2018 Fiscal Year Research-status Report
新規赤血球因子を介したマラリア原虫増殖抑制機構の解明
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17K07134
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| Research Institution | Nagoya University |
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Principal Investigator |
大野 民生 名古屋大学, 医学系研究科, 准教授 (90293620)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ゲノム編集 / 赤血球 / 原虫増殖抑制遺伝子 / ネズミマラリア原虫 / マウス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
マウス９番染色体にはChar1/Pymrという強力なマラリア抵抗性遺伝子座が存在しているが、その原因遺伝子は同定されていない。代表者の解析により、骨髄や赤芽球で特異的に発現するRnf123遺伝子が有力な候補遺伝子と考えられたため、ゲノム編集技術でこの遺伝子の欠失マウスを作製し、マラリア原虫の増殖抑制機構を解明することを目的として解析を実施した。NC系統等のマラリア感受性系統はRnf123遺伝子が高発現しているため、CRISPR/Cas9システムによりNC系統のRnf123遺伝子を欠損した系統を作製・樹立した。赤血球の性状解析を実施した結果、欠失系統ではMCV(平均赤血球容積)の低下とMCHC(平均赤血球ヘモグロビン濃度)の上昇を示し、Rnf123遺伝子が赤血球の形成に何らかの機能を有していることが判明した。次に、ネズミマラリア原虫の感染実験を行い、Rnf123遺伝子欠失系統のマラリア感染感受性を解析したところ、原虫の増殖抑制とそれに伴う生存率の上昇が認められた。しかし、９番染色体に存在するマラリア抵抗性遺伝子座の絶大な効果と比較すると、Rnf123遺伝子欠失によるマラリア抵抗性への効果は限定的であり、Char1/Pymr領域にはRnf123遺伝子以外にマラリア抵抗性を規定する遺伝子が存在する可能性が高いと考えられた。そこで、Char1/Pymr領域内に存在する遺伝子のうち、その産物が赤血球内に存在しその機能が明らかにされていないApeh遺伝子に着目し、ゲノム編集技術による欠損マウスの作製に着手した。Apeh遺伝子内には感受性系統特異的なアミノ酸置換がエクソン3に存在するため、NC系統のApeh遺伝子を欠損したKO系統と同時にそのアミノ酸置換部位を正常型に変換したKI系統(p.89P>R)の両方の作出を試み、両系統(KO, KI)ともにファウンダー個体を得ることに成功した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
マラリア抵抗性の原因遺伝子として極めて有力と考えられたRnf123遺伝子について、CRISPR/Cas9システムによりマラリア感受性のNC系統を遺伝的背景とした欠損マウス系統の作製に成功し、この欠損マウスが赤血球異常とマラリア抵抗性を示す事を明らかにした。しかし、その効果はChar1/Pymr遺伝子座の効果と比較するとかなり小さいため、本遺伝子座の原因としてはRnf123以外の遺伝子が関与しているという当初の想定とは異なる結果となった。そのため、Rnf123遺伝子以外にApeh遺伝子のKO系統とKI系統の作製が必要となったため、全体的に研究の進展が少し遅れている。
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| Strategy for Future Research Activity |
(1)30年度に作製したApeh遺伝子のKOとKIのファウンダー個体からApeh遺伝子KO系統とKI系統を樹立して、血球計数装置で赤血球数、ヘマトクリット値、平均赤血球容積、平均赤血球ヘモグロビン量、平均赤血球ヘモグロビン濃度、赤血球粒度分布幅等を測定する。更に、2種のネズミマラリア原虫(P. yoelii 17XLとP. chabaudi AS)の感染実験を行い、感染後の血虫率(感染赤血球数/全赤血球数)と生存率を測定し、Apeh遺伝子のマラリア抵抗性への関与を検証する。
(2)マラリア感染感受性系統（A/J, C3H, NC）と抵抗性系統（C57BL/6J, CBA, 129X1）間では、赤血球形成に関与すると考えられる複数の遺伝子の発現パターンが異なっていることを見出している。そこで、Apeh遺伝子KOとKI系統についてこれら遺伝子の発現を解析し、Apeh遺伝子のマラリア抵抗性に関わる遺伝子群の特定を行う。
(3)Rnf123遺伝子に加えApeh遺伝子でもマラリア原虫の増殖抑制が説明できない場合は、Char1/Pymr領域内に存在する約70個の遺伝子のうち、その産物が赤血球内に存在し機能が明らかにされていない他の2遺伝子（Actl11, Gmppb）についても同様にゲノム編集技術で欠損マウスを作製して解析を行う。
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| Causes of Carryover |
当初の想定通りRnf123遺伝子がChar1/Pymr遺伝子座のマラリア抵抗性の原因遺伝子である事が判明していれば、Rnf123遺伝子の遺伝子発現レベルを調節している遺伝子変異の探索と、Rnf123遺伝子に関連してマラリア抵抗性に作用する関連遺伝子群の探索を行う予定であった。しかし、Rnf123遺伝子欠損系統の解析により、本遺伝子が原因でないことが判明し、それらの解析は中断することになったため次年度使用額が生じた。それらの解析は、Rnf123遺伝子欠損系統に引き続き作製中のApeh遺伝子KO系統とKI系統に対して実施する事になるので、そのための消耗品経費とそれらマウスの飼育に係る経費として31年度に使用する予定である。
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