造血幹細胞の骨髄ホーミングにおける糖鎖の機能解析と糖鎖付与による効率向上の試み

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07135
• Research Institution: Kyoto University
• Principal Investigator: 成瀬 智恵 京都大学, 医学研究科, 助教 (30372486)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 浅野 雅秀 京都大学, 医学研究科, 教授 (50251450)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 造血幹細胞 / マウス / beta4-GalT1

Outline of Annual Research Achievements

我々が作製したβ4ガラクトース転移酵素-1ノックアウト（β4GalT-1-/-）マウスの骨髄細胞がレシピエントマウスの骨髄に生着できない原因を明らかにするため，今年度は（１）２匹のマウスの血流をつないで共有させるパラバイオーシスを用いて，β4GalT-1-/-造血幹細胞が野生型マウスに生着するかどうかを解析した。また，（２）β4GalT-1-/-骨髄細胞の幹細胞を，フローサイトメーターを用いて定量的に解析した。研究結果は以下の通りである。（１）CAG-GFPトランスジェニック（GFP+）マウスと野生型マウスの２匹をつなぐパラバイオーシスを行い，２，３週間後に野生型マウスにGFP+マウスの造血幹細胞が移行したかどうかを，野生型マウスの骨髄を培養することで調べた。野生型マウスの骨髄細胞をMethocult3434培地で培養したところ，GFP陽性コロニーが1-6%程度得られたので，パラバイオーシスによって数%の造血幹細胞が移行すると考えられた。しかしながら，全く得られないこともあり，実験結果が安定しないので，遺伝背景を考慮する必要などがあると考えられた。（２）骨髄細胞のコロニーアッセイによってβ4GalT-1-/- マウスの広義な造血幹細胞が野生型と同数存在することがわかっていたが，さらにフローサイトメーターを用いて定量的に造血幹細胞の割合を調べた。Lineage-; c-kit+, Sca-1+; Flk2-; CD34-; CD150+で選別した造血幹細胞の割合を調べた結果，β4GalT-1-/- マウスと野生型で差がないことが確認できた。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

フローサイトメーターを用いてβ4GalT-1-/-マウスの骨髄にある造血幹細胞や，それぞれのマーカーを発現する造血前駆細胞の割合を明らかにすることができた。また，パラバイオーシスを行う実験系の検討も行なったため。

Strategy for Future Research Activity

野生型とβ4GalT-1-/-マウスの造血系細胞を比較した時に，糖鎖構造の違いが見られるタンパク質を同定するためTOF-MAS解析を行う。また，ホーミングができなくなる原因と考えられるタンパク質やそのタンパク質の糖鎖付加部位をノックアウトすることで，原因タンパク質を特定する。さらに，GalT1を造血幹細胞にノックインすることで表現型がレスキューされるかどうか調べる。

Causes of Carryover

実験に用いる消耗品は，代理店が行うキャンペーンや試供品などを活用することで節約することができたため，次年度使用額が生じた。翌年度分と合わせて，外部委託やキットを購入し，時間と予算を有効に使用できるようにする計画である。