2017 Fiscal Year Research-status Report
発生工学的手法を用いた遺伝子改変不妊モデルマウスの解析
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17K07139
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
竹田 直樹 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 助教 (90304998)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 精子 / 遺伝子改変マウス / 疾患モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
精子特異的核タンパク質プロタミンの発現異常は、男性不妊に関する臨床報告が多数報告されており、不妊疾患の要因であることは明らかである。プロタミンは精子発生の最終過程でヒストンと置換されるDNA結合タンパク質であり、染色体の凝縮や精子形態形成に関わるとされているが、不妊に至るメカニズムを含め未だ不明な点が多い。その原因としては生殖に異常を来す変異体は系統の作製や維持が困難である為に動物モデルが少ない点があげられる。
我々は不妊の原因であろうプロタミンを欠損させたマウスを作製し、不妊にいたる機序と役割の解明を検討している。プロタミンはヒト及びマウスではPrm1とPrm2の2種類が確認されている。我々はすでにPrm1ノックアウトマウスの作製し解析をおこなっており、ヘテロ変異体においてその精子は運動能の著しい減退の為に不妊となることを明らかにした。（Takeda et.al. Scientific Reports, 2016）これまで精細胞は半数体でありながら細胞質架橋を通じて産物を分配し、表現型としては二倍体の様に振る舞うとされてきた（Braun et.al. Nature,1989）。しかし我々はプロタミンでは細胞質架橋による遺伝的劣勢の代償機構は不十分であること。さらに半数体精子でプロタミンmRNA及びタンパク質の量的発現機構が厳密であることを本報告で示唆した。
次に、我々は精子完成過程においてまず前駆体として発現され、切断によって成熟型となるPrm2ノックアウトマウスを複数系統作製して解析をおこなった。その結果、Prm2ノックアウトマウスは、ヘテロ変異体で不妊となるPrm1ノックアウトマウスと異なり、ホモ変異体で不妊であった。この結果は同一ファミリーでありながら、その量的および機能的差異があることを示している。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
雄性不妊疾患モデルであるPrm1ノックアウトマウスとPrm2ノックアウトマウスを作製し、系統を維持している。
Prm1変異体はヘテロ変異で♂は不妊となるために、変異♀マウスでの系統維持が必要であり、これまではホモ変異体の解析はできなかった。しかし我々が開発した発生工学的手法によって、Prm1ホモ変異マウスを作製することができた。本手法の開発によって不妊変異体をレスキューする技術を確立できたと共に、通常では得ることが出来ない優勢雄性不妊ホモ変異体を量産することを可能にした。現在、Prm1ホモ欠損精子を野生型およびヘテロ由来精子と比較しながら解析をおこなっている。
一方、Prm2は様々な塩基欠損を伴う変異マウス系統を樹立したため、まずそれら複数系統の変異同定と維持をおこなうと共に、妊孕性の確認をおこなった。Prm２変異体は予想に反しヘテロ雄では妊孕性が有り、ホモで精子遊走能の喪失が原因と思われる不妊を呈した。さらに解析を進めたところ、樹立した各系統のホモ雄マウスは不動精子であることは一致するが、それ以外の解析で差異が見受けられた。この事から塩基欠損でフレームシフトが生じ、その産物には機能差があると推測された。タンパク質の解析が急がれるが、Prm1とPrm2はいずれのプロタミンも5kD程度と小さいことと、解析に必要な抗体の入手が難しく、抗体の新規作成も試みたが不発に終わり遅延している。これらの事からタンパク質の解析には一層の工夫が必要である。またPrm2欠損による異常の本質が何であるのか、また各塩基欠損による表現型の差異が何を示すのかはとても興味が持たれる。しかしそれを明らかにするまでは、これら複数系統の維持と解析を同時並行的におこなう必要があり、進展の律速となっている側面もある。
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| Strategy for Future Research Activity |
Prm1ノックアウトマウスは、発生工学的手法によるホモ雄マウス作製をおこないつつ、野生型およびヘテロとの比較をおこないながら解析を進める。
Prm2ノックアウトマウスもPrm1と同様に解析を進めるが、系統数が多いのが律速である。
ヒト雄性不妊疾患では、プロタミンタンパク質の発現比率の異常が多く見られる。核結合タンパク質であるプロタミンの発現異常は、精子完成過程での遺伝子発現を乱すために、そのプロファイルの解析は重要と考えられ、そのためのDNAマイクロアレイでの解析は研究計画の筆頭であった。しかし表現型の異なる系統が増えたためにすべて解析するには予算的に厳しい状態である。そのため解析をおこなう前に、Prm2変異体による普遍的な表現型と、変異系統間の差異を見出し、解析する変異系統を絞り込むことが求められる。
プロタミンはDNAの凝縮に関わるとされるが、精子であることから汎用光学的な観察には限界がある。一方で単細胞であることを利用して、DNA結合色素やチオール基反応性色素を用いたFACS解析や、画像処理ソフトを用いることによって、多くの精子のデータを取得することにより統計的に解析をおこなえる利点もある。これらは既に一部の系統に対して開始しており今後はその拡充を図る。また大阪大学超高圧電子顕微鏡センター光岡薫教授と電子顕微鏡による微細構造の観察を進めている。
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| Causes of Carryover |
作製した複数の変異マウスの表現型に差異が見られ、当初予定していたDNAマイクロアレイによる解析がおこなえなかったため。
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