2018 Fiscal Year Research-status Report
発生工学的手法を用いた遺伝子改変不妊モデルマウスの解析
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17K07139
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| Research Institution | Kumamoto University |
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Principal Investigator |
竹田 直樹 熊本大学, 生命資源研究・支援センター, 助教 (90304998)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 精子 / 遺伝子改変マウス / 疾患モデル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
プロタミンは精子発生過程に発現する特徴的なＤＮＡ結合タンパク質である。その発現と同じくして染色体の凝縮や精子に特徴的な形態変化が見られること、またヒトではプロタミンの発現異常と男性不妊に関する症例が多数報告されている事などから、精子発生や形態形成、受精能獲得に関わるとされている。一般的に生殖異常を呈する変異体は作製や系統維持が困難であることから自然突然変異を持つような変異体が少ないため、我々は遺伝子改変マウスを作製しその解析を試みた。
プロタミンはヒト及びマウスではPrm1とPrm2の2種類が確認されている。我々はこれまでにES細胞を用いたジーンターゲィング法によりPrm1-KOマウスを作製し、その結果Prm1はヘテロ変異体において精子運動能の著しい減退の為に不妊となることを明らかにした。（Takeda et.al. Scientific Reports, 2016）
次に、我々はまず前駆体として発現され切断によって成熟型となるPrm2を、ゲノム編集法を用いて複数系統作製し解析をおこなった。
その結果、Prm2ノックアウトマウスは、ヘテロ変異体で不妊となるPrm1ノックアウトマウスと異なり、ホモ変異体で不妊であった。観察の結果、Prm2ホモ精子ではミトコンドリア膜電位を喪失している事や頭部が矮小であること、さらにPrm1ヘテロ由来精子よりも運動能が減退していることが明らかとなった。一方で複数の異なる遺伝子変異を持つホモ系統の精子形態で差異が見られることから、導入した遺伝子変異によって影響の程度が異なることが示唆された。
この様にPrm1とPrm2は同一ファミリーでありながら、その量的および機能的差異があることが明らかになった。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
雄性不妊疾患モデルであるPrm1ノックアウトマウスとPrm2変異導入マウスを作製し、系統を維持している。
Prm1変異体はヘテロ変異で♂は不妊となるが、我々が開発した発生工学的手法によってPrm1ホモ変異マウスを作製した。現在、Prm1ホモ欠損精子を野生型およびヘテロ由来精子と比較しながら解析をおこなっている。
一方、Prm2は様々な塩基欠損を伴う変異マウス系統を樹立したが、導入した変異によって表現型が異なることが示唆された。そこで各系統を比較しながら進めるために同時並行で維持、解析用ホモを調達している。
Prm1はジーンターゲティング法を用いて相同組換えによって遺伝子を欠損させ変異マウスを作製した。しかしプロタミンの様な極めて時期組織特異的に発現する遺伝子に対しては、ジーンターゲィング法は極めて効率が悪い。そこでPrm2変異マウスの作製にはゲノム編集法を用いた。しかしこの方法の欠点は様々なindel変異が生じる一方、オフターゲット効果も高いと言われている。各変異体での異なる表現系もこれに依存する可能性を否めないため、主にオフターゲット変異を除去することを目的として各変異系統を野生型C57BL/6と交配させている。
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| Strategy for Future Research Activity |
前年と同様にPrm1ノックアウトマウスは、発生工学的手法によるホモ雄マウス作製をおこないつつ、野生型およびヘテロとの比較をおこないながら解析を進める。Prm2変異マウスはPrm1と同様に解析を進めるが、系統数が多いのが律速である。
ヒト雄性不妊疾患においてプロタミンタンパク質の発現比率の異常が多く見られ、それが各々の精子の受精能獲得に関与しているかが問題である。その発現解析はシングルセルである精子のタンパク質プロファイルが適しているがそれは困難である。その代替法として我々はフローサイトメトリーを用いた解析法を導入し、DNA結合色素やチオール基反応性色素、ミトコンドリア膜電位感受性色素、SCSA（精子核構造解析）をすることで精子それぞれの特徴を、各系統で見出す予定である。
またPrm1変異体についてはすでに大阪大学超高圧電子顕微鏡センター光岡薫教授と電子顕微鏡による微細構造の観察を進めている。
さらにプロタミン欠損/変異がいつから影響を与えているのか、精子発生から成熟過程を区切って解析を進める予定である。
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| Causes of Carryover |
作製した複数の変異マウスの表現型に差異が見られ、当初予定していたDNAマイクロアレイによる解析がおこなえなかったため。
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