2018 Fiscal Year Research-status Report
希少疾患マウスモデルを用いた新規分子創薬標的の同定
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17K07149
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| Research Institution | National Center for Global Health and Medicine |
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Principal Investigator |
岡村 匡史 国立研究開発法人国立国際医療研究センター, その他部局等, 実験動物管理室長 (00333790)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 希少疾患 / シスチノーシス / マウス / 連鎖解析 / 量的形質遺伝子座解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
希少疾患研究から新たな分子創薬標的が発見され、新薬開発への手がかりを提供することがいくつかの疾患で示されている。本研究は、希少疾患であるシスチノーシス（シスチン症）モデルマウスを用いて、マウス系統差を利用した連鎖解析により、新たなシスチン代謝関連遺伝子座を同定する。系統差を利用した修飾遺伝子の探索は、実験動物学では古くから行われていることであり、次世代シークエンサーを用いたゲノム解析、およびゲノム編集などの新しい技術を活用し、新たな分子創薬標的を同定することを最終的な目的とする。
シスチノーシスの原因遺伝子であるCtns遺伝子を欠損したマウスでは、ヒトと同様に全身性にシスチンが蓄積するが、その蓄積量と病態はマウスの遺伝的背景が大きく影響することが報告されている。申請者らはその系統差に注目し、ゲノム編集技術を用いて、Ctns遺伝子変異をC57BL/6およびFVB 系統に導入したノックアウトマウスを作製した。前年度までの解析により、C57BL/6背景の肝臓、眼球、脾臓および腎臓において、FVB背景に比べ顕著にシスチンが蓄積していることが明らかとなっている。一方、52週齢における腎臓の病理学的解析においては、両系統間で顕著な差は見られず、連鎖解析に使用する量的形質としては適切ではないと判断した。
これらの形質を用いて連鎖解析、あるいは量的遺伝子解析を行い、新たなシスチン代謝関連遺伝子座を同定することで、生体内におけるシスチン量を修飾する遺伝子を同定する。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
ゲノム編集技術を用いて、マウスCtns遺伝子に変異を導入したマウスをC57BL/6およびFVB系統で作製した。ヘテロ接合体を交配し、ホモ接合体を作製した後に、経時的に各組織のシスチン濃度を測定した。これまでの解析により、C57BL/6背景のノックアウトマウスでは、FVB背景に比べ、肝臓、眼球、脾臓および腎臓の蓄積が顕著であることがわかっている。交配実験により、劣性遺伝様式が示唆されたため、N2個体を49匹作製し、102個のマイクロサテライトマーカーを用いて、N2個体群の遺伝子タイピングを行った。さらに質量分析装置を用いて、N2個体18匹の各組織におけるシスチン量を測定した。
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| Strategy for Future Research Activity |
使用するN2個体は100匹程度を予定しており、平成31年度は、引き続き102個のマイクロサテライトマーカーを用いて、N2個体群の遺伝子タイピングを行う。さらに、引き続き質量分析装置を用いて各N2個体の各組織におけるシスチン量を測定する。各N2個体の各組織におけるシスチン量の分布から遺伝様式を推定し、単一劣性遺伝子が想定される場合は、カイ二乗検定による相関解析および連鎖解析を行う。複数の原因遺伝子が想定される連続形質の場合は、量的形質遺伝子座解析を行う。連鎖が見られた染色体については、さらにマーカーを増やし詳細にマッピングする。また、マウスからゲノムDNAを抽出し、次世代シークエンサーによりゲノム解析を行う。他の正常系統のゲノムと比較し、エクソンにおける塩基の置換、欠失や挿入をリストアップする。アミノ酸置換が見られる遺伝子に関しては、アミノ酸置換がタンパクの構造や機能の与える影響を予測(タンパク質の機能障害予測)するソフトであるSIFTおよびPolyPhen-2を用い、原因遺伝子を同定する。さらに、C57BL/6およびFVB 背景ノックアウトマウスの肝臓あるいは腎臓のRNA seq解析による発現解析を行い、候補遺伝子を探索すると共に、その分子メカニズムを明らかにする
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| Causes of Carryover |
今年度に連鎖解析および量的形質遺伝子座解析を予定していたが、C57BL/6背景ノックアウトマウスホモ接合体の妊孕性が低下しており、十分な産子を得ることができなかった。そのため、ヘテロ接合体の使用し、さらに体外受精による個体生産を実施したため、N2個体群の作製に若干の遅れが生じた。また、両系統のシスチン蓄積量に顕著な差が見られのが、25週齢以上であることも研究計画が遅れた原因の一つである。しかしながら、これらの問題はすでに解決しているため、次年度に連鎖解析によりシスチン代謝関連遺伝子座を同定し、原因遺伝子変異を同定する。今年度に実施予定であった、次世代シークエンサーによりゲノム解析、および肝臓あるいは腎臓のRNA seq解析による発現解析を実施するために約90万円を次年度に繰り越した。
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Research Products
(1 results)
