2017 Fiscal Year Research-status Report
新規乳がん骨転移モデルの解析を通した、新規標的分子の探索
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17K07159
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
佐々木 宗一郎 金沢大学, がん進展制御研究所, 助教 (50583473)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
向田 直史 金沢大学, がん進展制御研究所, 教授 (30182067)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 乳がん / 骨転移 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Triple-negative (TN) 乳がんにおいては、高頻度で起きる骨を含む種々の臓器への転移が、患者の生命予後に大きく影響する。骨転移過程では破骨細胞が活性化するため、破骨細胞を標的とした薬剤の投与が行われている。しかし、これらの薬剤は対症的であり、顎骨壊死などの重篤な副作用を引き起こすこともあり、骨転移の分子・細胞基盤の解明に基づいた新たな治療法の開発が求められている。
研究代表者は、マウス乳がん細胞株4T1から、乳房脂肪組織移植によって骨への自然転移を高率に起こす乳がん細胞株4T1.3を樹立し、骨転移過程の解析を行ってきた。その結果、4T1.3が産生するケモカインCCL4の作用で、骨髄内に集積した線維芽細胞が産生する結合組織成長因子(CTGF)によって、がん細胞の増殖に有利な微小環境が構築されることを明らかとした。
骨髄内に集積する線維芽細胞と腫瘍細胞との相互作用をより詳細に解析するため、骨髄内微小環境下にある4T1.3と骨髄内に集積した線維芽細胞をフローサイトメトリー法にて分取し、それぞれの遺伝子発現を包括的に検索した。骨髄内に投与した際に4T1.3のみで発現が亢進する受容体分子を選択し、さらに骨髄内に集積した線維芽細胞において、上記で選択した受容体に対応するリガンドの発現が亢進している、受容体-リガンドの組み合わせを候補分子とした。受容体分子の発現をフローサイトメトリー法、ウエスタンブロッティング法を用いてタンパクレベルで検討することで、さらなる絞り込みを実施した。最終的に絞り込まれた候補受容体分子に対して、CRISPR-Cas9法を用いて候補遺伝子の発現を抑制した4T1.3株を作成し、候補受容体分子の腫瘍細胞株への影響を検討した。現在はこれらの細胞株による骨髄内投与モデルならびに同所接種自然骨転移モデルを用いて、骨転移に対する機能解析を進めている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
骨髄内に4T1.3ならびに親株を投与したマウスから線維芽細胞ならびに腫瘍細胞をフローサイトメトリー法にて回収し、SAGE法、RNAseq法を用いて包括的な遺伝子解析を行った。骨髄内に投与した際に4T1.3のみで発現が亢進する受容体分子を選択し、さらに骨髄内に集積した線維芽細胞において、上記で選択した受容体に対応するリガンドの発現が亢進している、受容体-リガンドの組み合わせを候補分子とした。これまでに1次スクリーニングは終了し、選択された候補分子の発現をCRISPR-Cas9によって抑制した細胞株も作成済みである。一方、候補分子の発現亢進のためのベクターもすでに構築し、発現誘導細胞株の作成に取り掛かっている。これらの手法により作成した細胞株を評価するためのスフェロイド形成法や、乳癌幹細胞マーカーによる解析法も確立し、順次解析を進めている。また、腫瘍を骨髄内に投与した際の骨髄内における候補分子の継時的な発現変化の解析と、リガンドを発現している線維芽細胞の動態の解析にも着手している。
以上の解析は初年度に実施を予定していた研究計画であり、本研究は当初に予定していた計画におおむね沿った進行具合であるといえる。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度までの研究で、骨髄内に集積した線維芽細胞と腫瘍細胞との相互作用を担っているいくつかの候補分子を同定した。これらの分子の発現を抑制した細胞株はすでに作成済みである。また、これらの分子の発現を亢進した細胞株の作成にも着手している。
今年度は、作成した細胞株を用いた解析を進める。まずはin vitroの系を用いて、候補分子の発現抑制・亢進による幹細胞性への影響を、スフェロイドの形成能、乳癌幹細胞能にて評価する。一方、骨髄内投与モデルならびに同所接種自然骨転移モデルを用いた解析を進め、候補分子の発現抑制・亢進による骨転移能への影響をin vivoの系からも評価する。
上記の解析の結果、自然骨転移能または骨髄内腫瘍増殖への抑制効果が期待される分子に対しては、骨髄内における候補受容体とそのリガンドの発現を継時的に解析し、骨環境によるこれらの分子の制御メカニズムを明らかとする。
以上の解析より同定された候補分子の乳癌の骨転移に対する機能を明らかとすることで、線維芽細胞と腫瘍細胞との相互作用を介する骨転移の新たな分子機構を解明し、骨転移に対する新規治療法を目指した研究を遂行する。
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