2017 Fiscal Year Research-status Report

Identification of the secondary mechanism for immune evasion in cancer at the immune checkpoint inhibition

Research Project

Project/Area Number	17K07171
Research Institution	Kyushu University
Principal Investigator	弓本佳苗九州大学, 生体防御医学研究所, 特任助教 (30596838)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	免疫チェックポイント
Outline of Annual Research Achievements	蛍光タンパク質tdTomatoを発現させたPD-L1欠損B16F1細胞を低濃度のエチルメタンスルホン酸で処理し、細胞に変異を導入した。この変異細胞をマウスに経脾移植し、肝臓に転移した169のクローン細胞を回収した。回収した細胞を再度マウスに経脾移植して、本当に転移能を獲得したかを確認したところ、ほとんどの細胞で転移能が獲得されていた。これらの転移能が獲得された細胞はを「抵抗性がん」に変化したとみなし、複数の細胞を選択してRNAseqをおこなってORF上の変異原やRNAの発現量変化を確認した。RNA発現情報からクラスター解析やGSEA解析、IPAによる解析を行い、真に重要な免疫チェックポイント阻害回避経路の絞り込みを行った。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 転移能を獲得した細胞をスムーズに得ることができ、RNA-seqによる発現解析も終了している。また本研究の目的である真に重要な免疫チェックポイント阻害回避経路の絞り込みも行っており、研究計画はおおむね順調である。
Strategy for Future Research Activity	EMS処理ではホモ欠損変異を得ることは難しいため、CRISPR libraryを用いたスクリーニングをおこなう。蛍光タンパク質tdTomatoを発現させたPD-L1欠損B16F1細胞をCRISPR library処理して細胞に変異を導入する。がん細胞をマウスに移植後、肝臓に転移したクローン細胞を回収する。回収した細胞を再度マウスに移植して、本当に転移能を獲得したかを確認する。転移能が獲得された細胞に関して、導入されたCRISPR配列を解析すると共に、RNAseqをおこなう。
Causes of Carryover	（理由）研究用資材の年度内購入ができなかったため。（使用計画）資材入手後は6月までに当初の研究計画を達成することができる。