2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K07172
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
飯森 真人 九州大学, 薬学研究院, 准教授 (20546460)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
北尾 洋之 九州大学, 薬学研究院, 教授 (30368617)
沖 英次 九州大学, 大学病院, 講師 (70380392)
佐伯 浩司 九州大学, 大学病院, 講師 (80325448)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 細胞質分裂 / ミッドボディ / OGG1 / 染色体不安定性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
染色体不安定性はがん細胞に広く見られる染色体分配異常であり、がんの悪性形質獲得や抗がん剤耐性獲得の要因であると考えられている。本研究では、細胞質分裂の完了に関与するOGG1の分子機序を明らかにする基礎研究を行い、さらにがん患者由来の臨床検体を用いてOGG1発現プロファイルと染色体不安定性の関連性を検証することで、OGG1の関与する細胞質分裂不全の分子病態と染色体不安定性の全体像を明らかにし，染色体不安定性を標的としたがん治療の可能性にアプローチするための学術的基盤を確立することを研究目的とした。
前年度までにライブイメージングによる観察から，OGG1ノックダウンにより細胞質分裂の二細胞への切断遅延が起こることを発見している。ここで見出された現象の詳細な観察を可能とするために，染色体と細胞質分裂期ブリッジの構成成分であるチューブリンの可視化細胞を樹立した。また細胞質分裂期におけるOGG1の局在性を明らかにするために，OGG1特異的抗体を用いた蛍光免疫染色やOGG1-FLAGタンパク質を発現させた細胞をFLAG抗体で蛍光免疫染色を行い，ミッドボディーと呼ばれる細胞質分裂期ブリッジの切断部位に形成される構造体部位にOGG1が局在することが観察された。さらに細胞質分裂の二細胞への切断遅延誘導に対するOGG1 関与を確証を得るために，ゲノム編集技術（CRISPR/Cas9 システム）を用いてOGG1 遺伝子ノックアウト細胞の樹立を試み,HeLa細胞を用いてOGG1ノックアウト細胞を樹立した。以上より、細胞質分裂期においてOGG1がミッドボディ因子の一員として細胞質分裂期ブリッジの切断への関与を強く示唆する結果を得ており，この発見の確証を得るためのさらなる検証を行っている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
研究申請時の研究計画では平成２９年度―３１年度の研究予定期間のうち、はじめに基礎研究として細胞質分裂の完了に関与するOGG1 の分子機序を明らかにする基礎研究を行い、さらにがん患者由来の臨床検体を用いてOGG1発現プロファイルと染色体不安定性の関連性を検証することで、OGG1 の関与する細胞質分裂不全の分子病態と染色体不安定性の全体像を明らかにすることを予定した。
平成２９年度はOGG1が細胞質分裂に関与する分子機序の解明に向けて，細胞質分裂の二細胞への切断遅延誘導に対するOGG1 関与の確証および酸化ストレス除去因子とは異なる、細胞質分裂で特異的に有するOGG1の 機能を検証した。平成３０年度にはこれまでに得られた知見がOGG1遺伝子ノックダウンによるものであるために，OGG1タンパク質を細胞内から完全に除くことが困難であると考えられたため，ゲノム編集技術（CRISPR/Cas9 システム）を用いてOGG1 遺伝子ノックアウト細胞の樹立を試みた。平成２９年度HeLa細胞を用いてOGG1ノックアウト細胞の樹立を試みたが，当研究室で実績のある方法ではノックアウト細胞は樹立できなかった。ここでOGG1遺伝子ノックアウトの方法を工夫することで最終的にはHeLa細胞を用いたOGG1ノックアウト細胞が樹立できたものの，当初計画していたよりも期間を有したと考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
最終年度である令和元年度には、平成３０年度にHeLa細胞を用いて樹立したOGG1ノックアウト細胞を用いて細胞質分裂の完了に関与するOGG1 の分子機序を明らかにする基礎研究を進めていく。細胞質分裂の完了に関与するOGG1の分子機序を明らかにする基礎研究に関しては，時期特異的なタンパク質分解誘導系であるオーキシンデグロン法を用いてOGG1を分裂期特異的に分解することでOGG1が細胞質分裂における機能を有するかの検証を予定しており，すでに細胞の樹立を試みている。また，すでに細胞質分裂期ブリッジの切断部位に形成されるミッドボディにOGG1が局在することを示唆する結果を得ている。ミッドボディには多くのタンパク質が局在して協調的に切断に関わることが知られており、OGG1 がどのような因子と結合し機能的に切断に関与するのかを明らかにするOGG1 の結合因子群を同定していく。OGG1 と同定された結合因子との免疫共沈降や共局在性の観察を行い、生理的な結合因子としての検証を行う。また、既知因子との機能的・局在的ヒエラルキーを決定するために、既知の切断責任因子の局在性がOGG1 によって制御されるかをOGG1ノックアウト細胞を用いて明らかにする。
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