2018 Fiscal Year Research-status Report
Extensive influence on malignancy by cancer specific mature mRNA re-splicing
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17K07182
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| Research Institution | Fujita Health University |
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Principal Investigator |
亀山 俊樹 藤田医科大学, 総合医科学研究所, 助教 (60298544)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | スプライシング異常 / 成熟mRNA再スプライシング / がん抑制遺伝子 / RNA結合因子 / EJC |
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| Outline of Annual Research Achievements |
mRNA前駆体スプライシングは厳密かつ正確に制御されているが、その破綻は細胞機能に異常をきたし、実際にがんを含む多くの疾患の原因となっている。我々は、スプライシングが完了した成熟mRNAが、がん細胞特異的に再びスプライシングされてしまうがん細胞特異的『mRNA再スプライシング現象』を、TSG101 mRNAを用いて証明してきた。このTSG101 mRNAの再スプライシング産物であるTSG101delta154-1054タンパク質はTSG101の安定化に働き、がん細胞の異常増殖、腫瘍の増殖、さらに転移能に関与していることが台湾のグループとの共同研究によって明らかにした。
このmRNA再スプライシング現象は多種多様ながんで広範に観察される一般的現象である。それ故、潜在的に多くのmRNA上で起こり、がんにおける大規模なトランスクリプトームの破綻を導いていると推測される。当然、正常細胞にはこのような過剰スプライシングが起こらないよう制御するメカニズムが備わっているに違いない。この様な仮説の基に昨年度にsiRNAライブラリーのスクリーニングを行った結果、がん抑制効果を持つ事が知られているRNA結合因子RBM4aがmRNA再スプライシングを抑制していることを見いだした。
また、mRNA再スプライシング現象はp53シグナルによって制御されることがよく知られており、本年度はp53によって制御される因子の探索をおこなった。MCF-7細胞にMDM2阻害剤を処置した時の遺伝子発現変動をマイクロアレイによって網羅的に行い、p53シグナルに影響を受ける遺伝子候補（48遺伝子）を選別した。次に48候補遺伝子のsiRNAによるノックダウン実験を行い、EJCのコア因子であるeIF4A3がRBM4a以上にmRNA再スプライシング抑制効果を持つことを見いだした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
mRNA再スプライシング現象はp53シグナルによって制御されることがよく知られており、本年度はp53によって制御される因子の探索をおこなった。MCF-7細胞にMDM2阻害剤を処置した時の遺伝子発現変動をマイクロアレイによって網羅的に行い、p53シグナルに影響を受ける遺伝子候補（48遺伝子）を選別した。次に48候補遺伝子のsiRNAによるノックダウン実験を行い、EJC（Exon Junction Complex:エクソン・ジャンクション複合体）のコア因子であるeIF4A3がRBM4a以上に強力なmRNA再スプライシング抑制効果を持つことを見いだした。他のEJC因子の効果を解析したところ、やはりEJCコア因子であるMagohとY14が強いmRNA再スプライシング抑制効果を持っていた。
EJCはスプライシング後のmRNAに結合し多くの機能を持つ事が知られる。しかしながら、mRNA再スプライシング制御に関しては、ナンセンス変異依存mRNA分解機構（NMD）や輸送、スプライシング制御など既知の機能に依存せずまったく新しい機能により制御される事を示唆する結果を得た。
さらに、eIF4A3ノックダウンによる遺伝子発現変化をRNA-seq解析により網羅的に行った。ウィーン天然資源大学応用遺伝学・細胞生物学科M.Kalyna研究室に依頼しデータ解析を行った結果、非常に多数のエキシトロン・スプライシングが抑制されていることが明らかとなり、がんにおけるトランスクリプトーム変化に多大な影響を与えることが示された。エキシトロンとはエクソン内に存在するイントロンであり、産物の類似性や細胞がん化で増える等の共通性から、mRNA再スプライシングと同じ機構により生じる可能性が考えられ、共同研究を進めていたが、その仮説も正しいことが明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
昨年度及び本年度の研究により、我々はRBM4a及びEJCコア因子（eIF4A3, Magoh, Y14）という複数のRNA結合蛋白質が成熟mRNA再スプライシング抑制因子として機能していることを発見した。
RBM4aはリン酸化によって制御を受ける。リン酸化型RBM4aは全くmRNA再スプライシングを抑制しない。一方、脱リン酸化型RBM4aのmRNA再スプライシング抑制能は野生型と比較し非常に昂進していることが明らかとなった。現在、リン酸化の変化によるRBM4aタンパク質の安定性およびTSG101 (pre-)mRNAへの結合能変化を調べ、RBM4aのmRNA再スプライシング抑制の分子機構の詳細を解析しているところである。
また、eIF4A3ノックダウンにより数百種類のエキシトロン・スプライシングに異常が生じることが明らかとなったが、その中には細胞がん化・悪性化とも直接関わる遺伝子が複数含まれていた。そのような候補遺伝子に関し、エキシトロン領域を含む産物と含まないスプライス・バリアント産物をそれぞれ細胞に強制発現させ細胞増殖や転移能に差が生じるか解析を進める。それにより、mRNA再スプライシングが、エキシトロン・スプライシング・バリアントを介して、細胞がん化及び悪性転化に重要な役割を担っていることを示す事が出来るものと期待している。
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| Causes of Carryover |
メーカー国内在庫が無かった物品があり、その納品が年度を超えて５月になってしまったため。
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