LncRNA解析による癌幹細胞の治療開発

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07196
• Research Institution: Osaka University
• Principal Investigator: 大塚 正久 大阪大学, 医学系研究科, 招へい教員 (20597455)
• Co-Investigator(Kenkyū-buntansha): 山本 浩文 大阪大学, 医学系研究科, 教授 (30322184)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 大腸癌 / 癌幹細胞 / LncRNA

Outline of Annual Research Achievements

癌幹細胞は、自己複製能・造腫瘍能・多分化能を有し、抗癌剤や放射線治療に抵抗性を示し再発・転移を繰り返す原因となる。癌幹細胞は癌細胞集団の中で極めて少数であるためその細胞特性や治療効果の評価が困難である。私たちはODC (Ornithine decarboxylase) -degron 遺伝子導入によって癌幹細胞を可視化、濃縮する手法を確立した。ODC-degronを大腸癌細胞株であるHCT116に遺伝子導入することによって癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団を分離した。初年度はRNA-sequencing法によるHCT116の癌幹細胞集団と非癌幹細胞集団で発現しているLncRNA (Long non-coding RNA) の網羅的な解析、The Cancer Genome Atlas (TCGA) データセットを用いた予後解析の結果、大腸癌の予後不良因子として2種類のLncRNA候補をピックアップした。平成30年度は、大阪大学消化器外科の100例以上の大腸癌組織から抽出したRNAサンプルを用いてqRT-PCRにより二つの候補LncRNAの発現を定量した結果、ひとつのLNC01534で、その高発現が有意に予後不良と関連することが分かった。LNC01534に対するsiRNAは、大腸癌細胞株HCT116の増殖を抑制し、細胞周期解析ではG2/M期での細胞周期停止を誘導した。一方、Annexin Vアッセイによる検討では有意なアポトーシス誘導はみられなかった。LNC01534-siRNAによってG2-M移行に働くCdc2, Cyclin B1, CDC25B, CDC25Cなどの蛋白発現が低下した。LNC01534-siRNAによるこれらの細胞効果はODC-degronを導入したHCT116癌幹細胞で顕著であった。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

本研究では3年間の研究期間内に、癌幹細胞の特性を賦与するゲノム、エピゲノム変化を見出し、自己複製と細胞分化のチェックポイント機構の仕組みを解明する。特にまだ不明な点が多いlncRNAの癌幹細胞における役割について重点的に検討し、癌幹細胞を死滅させる治療的核酸製剤の創出を行うという目標設定をしていた。これまでに癌幹細胞モデル細胞から、大腸癌患者の予後不良に関わり、癌幹細胞の増殖と細胞周期のG2-M移行に働く新規LNC01534を同定できた。最終年度でこのLncRNAに特異的な分子制御と細胞内局在を組織切片上で明らかとすることを残すのみであることから、研究の進捗としては概ね順調である。

Strategy for Future Research Activity

最終年度では、このLncRNAの局在をIn situ hybridizationで明らかとすることと、LNC01534の機能面で特異な役割を解明する。そのために平成30年度のうちにmRNAの保存に優れるマイクロウエーブ固定を施した大腸癌組織サンプルのパラフィンブロックを準備した。また、大腸癌細胞にsiRNA処理をした後にRNAseqを実施してOntology解析やIPAによる分析を通じて、小胞体ストレス分子群を介したG2-M制御のシナリオが描けている。最終年度では、これらのパートを完成させ論文投稿を目指す。

Research Products

• [Presentation] Long Noncoding RNA Regulates Cancer Stem Cells in Colorectal Cancer (2019)
  • Author(s): Masahisa Ohtsuka, Naotsugu Haraguchi, Norikatsu Miyoshi, Hidekazu Takahashi, Taishi Hata, Chu Matsuda, Masahiro Tanemura, Hiroki Akamatsu, Tsunekazu Mizushima, Yuichiro Doki, Masaki Mori, Hirofumi Yamamoto
  • Organizer: 11th AACR-JCA Joint Conference on Breakthroughs in Cancer Research: Biology to Precision Medicine
  • Int'l Joint Research
• [Presentation] 大腸癌における癌幹細胞関連長鎖非コードRNAについての検討 (2019)
  • Author(s): 大塚 正久, 原口直紹, 池嶋 遼, 大原 信福, 三吉範克, 高橋秀和, 畑泰司, 松田 宙, 種村匡弘, 赤松大樹, 水島恒和, 土岐祐一郎, 森 正樹, 山本 浩文
  • Organizer: 第119回日本外科学会定期学術集会