2017 Fiscal Year Research-status Report

A novel immunotherapy for advanced renal cell carinoma by glycobiological interaction with natural killer cells

Research Project

Project/Area Number	17K07210
Research Institution	Tohoku University
Principal Investigator	川崎芳英東北大学, 医学系研究科, 助教 (80722256)
Co-Investigator(Kenkyū-buntansha)	荒井陽一東北大学, 医学系研究科, 教授 (50193058) 佐藤信東北大学, 医学系研究科, 非常勤講師 (70282134) 伊藤明宏東北大学, 医学系研究科, 准教授 (70344661) 三塚浩二東北大学, 大学病院, 講師 (80568171) 泉秀明東北大学, 医学系研究科, 助教 (80722545) 嶋田修一東北大学, 大学病院, 助教 (80749218) 佐藤琢磨東北大学, 大学病院, 助教 (80804856)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	DSGb5 / 腎細胞癌 / NK細胞 / 脂肪酸
Outline of Annual Research Achievements	これまでのin vitroの実験において、腎癌細胞上にNK細胞の細胞傷害活性を抑制する糖鎖抗原の発現を明らかにした。また、その糖鎖抗原を制御することで、NK細胞の細胞傷害活性が賦活することも確認した。しかし、臨床上は、腎腫瘍全体として、その糖鎖抗原の発現量が小さい場合は、NK細胞を賦活化させた効果が非常に限定的なものとなってしまうことが予想された。このように、本研究を進めていく過程で、腎細胞癌の糖鎖抗原の定量という課題に直面した。そこで、質量分析器による試料中の糖鎖抗原の定量に着手した。今回、NK細胞との相互作用が確認されている、DSGb5糖鎖の定量のための実験系を組み立てた。DSGb5糖鎖は糖脂質であり、これに含まれるスフィンゴ糖脂質はセラミド部分の脂肪酸および糖鎖の配列部分に多様性を有する。抗体は糖鎖をエピトープとして認識するため、脂肪酸配列については不明である。こうした分子種を識別して精密に同定しつつ、定量的に解析する手法として液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法 (LC/MS/MS) を用いた。腎癌細胞株ならびに上清、さらに患者検体尿中のDSGb5糖鎖の検索を行った。試行錯誤の結果、腎癌細胞株培養上清において、炭素数16から26までの異なる脂肪酸鎖8種を測定対象に設定するとことで、DSGb5糖鎖を定量できることが明らかになった。さらに、腎癌患者尿にいても微量ではあるもののDSGb5糖鎖を定量することが可能であった。以上により、同時に施行していたin vitroおよびin vivoの実験、さらには患者検体を用いた臨床研究への応用が期待できる状況となった。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 研究過程において、腎細胞癌の糖鎖抗原の定量という課題が見つかったことにより、当初予定した進捗状況より、大幅に遅延することとなった。今回、ターゲットとしたDSGb5は糖鎖脂質であり、標準物質が市販されておらず、液体クロマトグラフィー／タンデム質量分析法 (LC/MS/MS)で測定するとしても、工夫が必要であった。しかし、Gb4糖鎖は標準物質として市販されており、Gb4 糖鎖をLC/MS/MSで測定することで、DSGb5の糖鎖部分の検出は可能と考えられた。DSGb5の脂肪酸配列には多様性があることが分かっていたが、これまでの文献から糖鎖の脂肪酸配列を炭素数16から26までの異なる脂肪酸鎖8種を測定対象に設定することで、DSGb5糖鎖の定量にめどがたった。実際、腎癌細胞株培養上清においてLC/MS/MSにより、DSGb5糖鎖を定量することに成功した。定量の技術は、今後、臨床応用の際に非常に重要な要素とであると考えられた。大幅な遅れと感じてはいるが、本研究全体を俯瞰すると、より臨床応用に近づきつつあると考えられ、おおむね順調に進んでいるかと思われる。
Strategy for Future Research Activity	以上に様に、DSGb5糖鎖の定量技術を確立したことで、DSGb5糖鎖をターゲットとしたNK細胞の賦活化による新規免疫療法が有効な臨床像を、明らかすることが可能になったものと考える。この定量技術については、当施設の薬学研究室より助言およびご指導をいただいた位。なお、このDSGb5糖鎖の定量技術に関しては、近日に学会報告および論文投稿ができる状況となっている。in vitroの事件と同時に、in vivoでの実験を進めている。また、実験経験の豊富な補佐員を雇ったことにより、これまでより短期間で多くの実験データを出せるようになり、試行錯誤する時間も増やすことができている。まずは、これまでの実験成果を論文等にて、着実に形にしていく方針である。研究計画通りに実験を進めていきく。今後も直面すると予想する課題については、実験補佐員の助言等も受け、少しずつ解決していきたいと考える。有効な対応策をとることが困難なこともあるかと考えるが、他研究室との連携を生かしつつ、想定した目標を目指して一歩ずつ推進させていく。
Causes of Carryover	平成29年度に予定していた、in vivoの実験を平成30年度に行うこととしたため、次年度使用額が生じたものと推察する。次年度使用額は、平成30年度の助成金と合わせて、さらなるin vitroの実験にかかる物品費として使用する計画である。なお、in vitroの実験の進行度を考慮し、in vivoの実験も進めていく予定である。その際は、ヌードマウス等の購入費としても次年度使用額を平成30年度の助成金と合わせて使用する計画である。