2018 Fiscal Year Research-status Report
がん細胞分泌性免疫抑制因子の同定による腫瘍悪性化機構の解明
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17K07219
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
狩野 有宏 九州大学, 先導物質化学研究所, 准教授 (30403950)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | がん細胞 / 脾臓 / 免疫抑制 / M-CSF / IFN-γ |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度までに、4T1細胞移植後に脾臓中に新たに出現する細胞を見いだし、また、N末、C末の両末端が翻訳後にプロセッシングされるM-CSFに、Tag配列を付加することに成功した。本年度はこれらの結果を踏まえた研究を実施すると共に、培養脾細胞のIFN-γ産生を抑制する液性因子の同定に再び取り組んだ。
(1) 6個のHistidineをコードする配列をM-CSFゲノムのN末領域に含む HDR (homology directed repair) 配列を合成し、CRISPR/Cas9システムと共に4T1細胞にトランスフェクションを行った。その後クローニングを行い、ノックインを検証した結果、ノックイン自体が起きているクローンはいくつか得られたものの、設計通りの配列を持つクローンは得られなかった。N末にHis配列を持つM-CSF遺伝子を4T1細胞に強制発現させ、恒常発現株の樹立を試みたが、その効率は、C末にHis配列を持つ遺伝子に比べ顕著に低い結果となった。このことから、N末にHis配列を持つM-CSFは細胞の成長に不利に働くものと考えられた。(2) 昨年度、4T1細胞培養上清10 Lを回収したものの、恐らく血清が混入したために、そのあとの分離精製過程が困難となり、全て廃棄するという事態となった。本年度再び培養上清10 Lの回収を終了した。現在慎重に分離精製を進め、疎水カラムによる分画と、活性確認を終了している。(3) Ly6-C, -G，MHC-II, F4/80, CD11bなどの既知の骨髄球の表面抗原の解析を実施し、4T1細胞移植によって出現する細胞の表面抗原に関する情報を得た。また本年度は、腫瘍内の免疫細胞の解析も行い、今後脾臓および腫瘍にそれぞれ出現する細胞との関係性解析のための情報を得ることができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
1. 昨年度、4T1細胞の培養上清中のIFN-γ産生抑制因子の同定のために10Lを回収したが、回収中に血清が混入したため、分離精製過程を中断した。そのための遅れが本年度計画にも影響した。再び10 Lを回収し、抑制因子の分離精製を進めている。
2. M-CSF遺伝子にHis-tag配列を挿入し、培養細胞に発現することに成功した。そこでCRISPR/Cas9システムによって細胞ゲノムへHis-tag配列の挿入を試みた。しかしながら、HDRが生じたクローンを得ることに成功したものの、ゲノム配列のシークエンスを解析した結果、設計通りの正しい配列を持った細胞クローンは確認できなかった。これは、挿入したHis-tagが細胞の成長に不利に働いたためと考えられた。現在異なるtag配列に変更し、再度同様の検討を試みている。また、M-CSFのlong form、short form、及びN末His、C末Hisでは、いずれもそのIFN-γ産生抑制に顕著な差は見られなかった。
3. 当初、セルソーターにより4T1細胞移植により新たに出現する細胞の分取、あるいは除去によって、IFN-γ産生抑制への関与について検証することを予定していた。しかしながら、セルソーターによる分離作業よって必要な細胞数を確保するためには丸一日かかることが判明した。また上記したように抑制因子の同定作業に遅れが生じたため本年度はその同定に注力した。一方で、今後の細胞機能解析のために、表明抗原の解析を進めた。
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| Strategy for Future Research Activity |
1. His-tagに代わるtagをM-CSF遺伝子に導入する。そのためのリンカー配列、シグナル配列等を検証し、効率よく発現するための配列を決定する。またHis-tagはNi-カラムによる精製が可能など利点もある一方、カチオンチャージを持つ同じアミノ酸が連続するというタンパク質発現に不利な局面があったが、新しいtagはそのような偏った配列を持たないため、十分高い発現も期待される。CRISPR/Cas9システムによってtag配列をノックインした細胞を作製し、long form及びshort formの発現解析を行う。またBalb/cマウスに移植を行い、血中濃度の定量、及び脾臓も含めた体内分布について検討する。
2. 回収した4T1細胞の培養上清10LからIFN-γ産生抑制因子の分離精製を進める。すでに疎水カラム分画まで終了しており、各分画物の活性測定と活性因子の同定を進める。またノックアウト細胞が樹立できていることから、この細胞の培養上清からの抑制因子の精製も可能な範囲で進める。
3. 4T1細胞の移植によって新たに出現する細胞が、4T1細胞のM-CSFによるものであるのかをM-CSFノックアウト細胞の移植によって検証する。また腫瘍内の免疫細胞との比較検討を実施し、抑制性細胞の起源について検証する。
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| Causes of Carryover |
今年度はHis-tag配列を4T1細胞遺伝子にノックインすることを試みたが、恐らくそれが細胞増殖に不利に働いたことにより、設計したクローンを得ることができなかった。そのため、動物実験も含め、ノックイン細胞を使った解析ができなかった。現在より高感度でかつ容易に扱える別のTagに切り替えてノックイン細胞を準備中である。本年度はそれを使ったM-CSF発現解析、及びマウスを使った体内動態解析を実施しする。また、現在再び4T1培養上清回収を終了し、分画精製に取り組んでいる。素分画まで終了していることから、本年度は各分画の活性確認と、活性因子の精製を実施する。繰越予算はこれらの目的に使用する他、昨年度活性分画のタンパク質同定のため予定していたMALDI-TOF-MS解析の予算を本年度に同じ目的で使用する予定である。
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Research Products
(2 results)
