2019 Fiscal Year Annual Research Report
Study for mechanisms of tumor progression by identification of immunosuppressive factors secreted from cancer cells
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17K07219
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
狩野 有宏 九州大学, 先導物質化学研究所, 准教授 (30403950)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | がん細胞 / IFN-γ / M-CSF / 脾細胞 / TAM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
(1) 昨年度、翻訳後に両末端がプロセッシングされるM-CSFのN末端にHis tagを挿入することに成功したものの、この配列の4T1細胞ゲノムへの挿入はうまくいかなかった。そこで本年度は、tag配列を他のペプチドに変更し、4T1細胞のM-CSFゲノム領域にノックインを行った結果、tag配列を持つ複数のクローンを得ることに成功した。この細胞の培養上清を回収し、tag配列のブロッティングを行った結果、約50 kDaの長鎖のM-CSFと同等の分子量付近に検出された。このことは、これまでの抗M-CSF抗体を使って検証してきた結果と一致していた。さらにこの細胞をBalb/cマウスに移植した結果、腫瘍を形成することを確認した。また、血液中においても十分な感度でtag配列を検出できることを確認した。このことは腫瘍が分泌するM-CSFが相当の濃度で血液中に存在することを示している。またこの方法により、内在性のM-CSFと腫瘍由来のM-CSFを区別して検出することが可能となった。
(2) 4T1細胞培養上清を10 L回収し、IFN-γ産生抑制因子の単離、同定を試みた。抑制因子の精製後に、二次元電気泳動を行った結果、およそ20個程度のタンパク質スポットが確認された。これらスポットを切り出し、トリプシン消化後にMALDI-TOF-MSにより、タンパク質同定を試みたが、今回の科研費期間内にIFN-γ産生抑制因子の同定にはいたらなかった。
(3) gRNAとCas9タンパク質だけを用いて、M-CSF、およびG-CSFのノックアウトを試みた。これにより外来遺伝子の挿入がない細胞株が得られると考えられる。実験の結果、効率よくいずれも10個以上のノックアウト細胞を樹立できた。これら細胞株のin vitroにおける増殖能を検証した結果、ノックアウト細胞も親株4T1細胞と大きく変わらない事が確認された。
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