2018 Fiscal Year Research-status Report
初期胚の核構造変化と細胞分化におけるゲノム動態のイメージング解析
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17K07241
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
坂本 尚昭 広島大学, 理学研究科, 准教授 (00332338)
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2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 初期型ヒストン遺伝子 / CenpA / Nucleolin / HP1 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
我々は、ウニの初期型ヒストン遺伝子座が発現の活発な桑実胚期に集積し、その挙動が転写活性と関連することを見出していた。そこで、詳細な挙動を解析するために、Histone Locus Bodyの構成因子であるLsm10のバフンウニホモログをクローニングし、GFPとの融合遺伝子を作製してウニ胚に発現させた。その結果、桑実胚の核内に幾つかの蛍光スポットが観察されたが、現時点ではこの蛍光スポットに初期型ヒストン遺伝子座が含まれるかどうかさらに検討する必要がある。
また、ウニの発生過程で反口側外胚葉特異的に発現し、その発現制御機構が解析されているHpArs遺伝子について、3D-FISH法による遺伝子座の可視化を試みた。HpArs遺伝子を含む約150 kbの領域に対して特異性の高い70箇所のゲノム領域（各領域の長さは平均1 kb）を選定し、PCR増幅により蛍光標識プローブを作製した。原腸胚を用いて3D-FISHを行ったところ、HpArs遺伝子座と思われる２つの蛍光スポットが検出された。現在、蛍光スポットの核内配置と組織との関連について解析中である。
また、核構造を可視化するためにNucleolin、CenpA、HP1とmCherryとの融合遺伝子を作製し、ウニ胚に発現させた。CenpA-mCherryの発現では、セントロメアに蛍光スポットが検出され、その分布は核内で偏っており、Rabl配向に近いと予想された。Nucleolin-mCherryの発現では、約４個の蛍光スポットが観察され、各スポットが近接する傾向があることが示唆された。HP1-mCherryの発現では、32細胞期の小小割球では核内に多数の蛍光スポットが観察されたのに対し、他の細胞系譜では核内に均一に分布していた。したがって、小小割球では他の細胞系譜よりも早く組織化（ヘテロクロマチン形成）が進行していると考えられる。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
3D-FISH解析では、HpArs遺伝子座の解析は順調に進行しているが、他の遺伝子座についてはHpArs遺伝子座での成功を確認したのちにも解析していく予定であり、やや遅れている。また、CRISPR-Cas9システムによる可視化系では、SUNTagシステムを使うようチューニングは行いつつあるが、まだ完成していない状態である。
核内の特定の領域に局在する因子と蛍光タンパク質との融合による解析は、おおむね順調に進んでおり、今後さらに詳細な解析を行っていく予定である。
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| Strategy for Future Research Activity |
3D-FISH解析では、HpTb遺伝子座等の領域についてもプローブを作製し、解析を進める予定である。HpArs遺伝子座については、CRISPR-Cas9システムによるエンハンサー領域への変異導入を確立し、変異と核内局在との相関について明らかにしていく。また、CRISPR-Cas9システムによる可視化系のチューニングを行い、まずはウニ胚におけるテロメアの動態を明らかにする。
核内の特定の領域に局在する因子と蛍光タンパク質との融合による解析は、さらに詳細な解析を行うとともに、様々な関連因子をモルフォリノによるノックダウンあるいはCRISPR-Cas9によるノックアウトにより阻害し、その影響についても解析する予定である。
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