2017 Fiscal Year Research-status Report
Genomic analysis of the YY supermale frog and identification of the mele-determining gene
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17K07242
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| Research Institution | Hiroshima University |
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Principal Investigator |
高瀬 稔 広島大学, 両生類研究センター, 准教授 (80226779)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | YY超雄 / 精巣分化 / ネッタイツメガエル |
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| Outline of Annual Research Achievements |
最初に、ネッタイツメガエルYY超雄を用いた交配により得られた全雄幼生集団および卵核二倍発生法により得られた全雌集団を用いて、それぞれの生殖腺分化過程を組織学的に解析した。Jamilら（2008年）により報告されているネッタイツメガエル性分化時期を参考にしてNKステージ47以降の幼生から取り出した生殖腺の組織切片を作製し、染色後に検鏡した。その結果、NKステージ47の生殖腺において、すでに雌雄間で異なる組織像が観察された。従って、これまでの報告よりも早いステージにおいて性分化が起こっていることが推察され、次年度に行う予定である精巣分化過程のRNA-seq解析用のサンプリング時期を決定するための貴重な情報になる。
次に、全雄集団の個体が正常な雄として成熟することを確かめるために、YY超雄とXX雌を交配して得られた全雄集団を成熟させた。その成熟雄の精子懸濁液を用いて人工媒精を行い、得られた受精卵のふ化率を調べたところ、XY雄とXX雌の交配によって得られた成熟雄を用いた場合のふ化率と比べて有意差はなかった。また、どちらの成熟雄においても活発な精子形成像が観察された。従って、全雄集団は精巣分化を解析するモデルになると考えられる。
さらに、YY雄とXX雌のゲノムDNA配列を比較して雄特異的ゲノム領域を特定するために、それぞれの個体から調整したゲノムDNAを用いて、次世代シークエンサーによるショートリード解析用ライブラリーを作成した。解析は現在も行っている。また、ショートリード解析後のゲノムDNAシークエンスデータのアセンブリをより確実にするために、ロングリード解析も併せて行っている。また、雄特異的ゲノム領域の染色体マッピングを行うために、染色体標本作製法を検討した。成体の心臓および肺、腎臓の細片を培養して得られた細胞を用いて、スライドグラス上に染色体標本を作製した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
次世代シークエンサーによるゲノム解析および雄特異的ゲノム領域の染色体マッピングを行う予定であったが、まだ終えていない。しかし、ゲノム解析についてはすでにライブラリー作製を終えており、ゲノムDNAシークエンスデータの取得および解析を行うのみである。また、染色体マッピングについても染色体標本作製法をすでに確立している。従って、今後早い時期にそれらの計画を遂行できると考えており、全体として「やや遅れている」という評価である。
また、今回の予定になかった精巣分化過程の組織学的解析や全雄幼生集団の精巣分化・発達の正常性の確認を行ったことから、今後行う予定である精巣分化過程のRNA-seq解析を速やかに行うことができると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
最初に、次世代シークエンサー解析により得られるYY雄およびXX雌のゲノムDNAシークエンスデータのアセンブリおよびアラインメントを行い、雄特異的ゲノム領域を選定する。選定したゲノム領域が雄特異的であることをPCR法および染色体を用いたFISH法により確かめる。また、それらの結果からY染色体が特定されると考えている。
次に、精巣分化過程において雄特異的ゲノム領域からRNAが転写されることを、次世代シークエンサーを用いたRNA-seq解析により確かめる。今回解析した全雄幼生集団の精巣分化過程における組織学的変化を参考にして、未分化生殖腺時期および精巣分化時期の生殖腺を中腎と共に取り出してRNAを抽出し、RNA-seq解析を行う。雄特異的ゲノム領域に含まれる遺伝子配列を持つRNAに着目し、その遺伝子について精巣分化過程における発現変化をqPCR法により解析する。また、in situハイブリダイゼーション法により発現細胞を同定する。
さらに、着目した遺伝子が雄決定遺伝子として機能していることをトランスジェネシス法およびノックアウト法により確かめる。卵核二倍発生法により全雌集団の受精卵を作製し、I-SceI meganuclease法により目的の遺伝子がトランスジェネシスされた個体において精巣が分化することを確かめる。また、YY超雄を用いた交配により全雄集団の受精卵を作製し、CRISPR/Cas9法により目的の遺伝子がノックアウトされた個体において正常な精巣分化が起こらないことを確かめる。以上により、ネッタイツメガエル雄決定遺伝子を同定する。
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| Causes of Carryover |
次年度使用額が生じた理由として、今回計画していた次世代シークエンサーによる解析および染色体を用いたFISH解析を次年度も引き続き行うためである。
助成金は、次世代シークエンサー解析およびFISH解析、PCR解析、in situハイブリダイゼーション解析、トランスジェネシス解析、ノックアウト解析のための受託やキット、薬品、器具、消耗品の購入、研究成果発表のための旅費等に使用を予定している。
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