2018 Fiscal Year Research-status Report
Establishment of an wheat cell-free based protein array of deubiquitinating enzyme and determination of specificity of polyubiquitin
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17K07261
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| Research Institution | Ehime University |
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Principal Investigator |
高橋 宏隆 愛媛大学, プロテオサイエンスセンター, 講師 (70432804)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 脱ユビキチン化酵素 / ユビキチン鎖特異性 / 脱ユビキチン化酵素阻害剤 / コムギ無細胞タンパク質合成系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、約100種類存在するヒトの脱ユビキチン化酵素（DUB）について、そのほぼ全てを組換えタンパク質を作製し、市販の８種類の２量体ユビキチンをモデル基質として切断アッセイを行い、各々のDUBの基質特異性を明らかにすることを目標とする。平成29年度に85種類のDUB組換えタンパク質の発現に成功し、そのうちの77種類の基質特異性を明らかにしている。
活性が得られなかった8種類のDUBについては、いずれも発現量が非常に低いことが大きな要因である。そこで本年度にこれらのDUBの発現条件の再検討を行い、少なくとも6種類について発現量を大幅に改善した。また、2016年に新規DUBとして報告されたFAM63Aについてもタンパク質合成に成功した。さらに、USPファミリーDUBについて、直鎖状ユビキチン鎖の切断活性に関わる部位の同定を目指した。本研究で得られたUSPファミリーDUBの直鎖状ユビキチン切断活性の生化学的データと、それらのDUBのアミノ酸配列をもとに、連携研究者の産業技術総合研究所の富井先生、今井先生によるインフォマティクス解析から、切断活性の有無に関わる候補アミノ酸を数個見出した。
また、DUBは様々な疾患に関連することから、近年新たな創薬ターゲットとして注目されており、特定のDUBのみを特異的に阻害する低分子化合物の開発が求められている。そのため、開発中の化合物についてほぼ全てのDUBを用いて特異性を評価できるシステムは非常に有用である。本研究では、定量性が高く、低分子化合物の干渉を受けにくいアッセイ系であるAlphaScreenを用いて、化合物のDUB活性阻害の評価を試みた。その結果、約40種類のDUBについて、阻害剤の特異性評価に成功した。今後、本研究で構築した試作型のDUB阻害剤評価パネルを改良することで、DUB阻害剤探索の強力なツールとしての実用化が期待される。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
1: Research has progressed more than it was originally planned.
Reason
平成29年度に全体の９割程度のDUBについて、活性の検出が終了していた。本年度は、発現量が低く、活性が検出できなかったDUBについて、その発現量の大幅な改善に成功している。また新たに報告された新規DUBの合成に成功し、予備実験では活性が検出された。さらに、USPファミリーDUBについて、直鎖状ユビキチン鎖切断活性の有無に関わるアミノ酸候補の選定を終えており、現在それらのアミノ酸を変異したDUBを作製中である。また、これら多数の活性型DUB組換えタンパク質を保有するアドバンテージを活かし、DUB阻害剤評価パネルの構築にも成功している。各々のDUBの基質特異性決定などの生化学的特徴付けは学術的に重要であるが、本研究ではこれに加えて、創薬を念頭においた応用研究への発展の可能性を示すことができた。このように、当初から目的とするヒトのほぼ全てのDUBのタンパク質合成とその基質特異性決定が予定通りに進行中であることに加えて、構築したマテリアルや実験系を用いて、新規なツール開発に踏み込むことができたことから、本研究は当初の計画以上に進展していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度に開始したDUB阻害剤評価パネルの開発については、より多くのDUBを用いて、さらに高い精度で阻害効果を評価できる系を構築する必要がある。本研究は最終年度であり、DUBプロテインアレイの完成を優先させるために、DUB阻害剤評価パネルの開発については、平成31年度より開始する新学術領域ケモユビキチン（高橋・H31-32）のプロジェクトにて行う予定である。
平成31年度は、以下の実験を計画している。
1.未解析DUBの基質特異性解析・・平成30年度に発現量の改善が認められたDUBや、新たに加えたDUBについて、他のDUBと同様に８種類の二量体ユビキチンを用いた基質特異性解析を行う。
2.活性が認められなかったDUBの検証・・上記の解析で活性が認められないものについて、基質を二量体ユビキチンから四量体ユビキチンや、モノユビキチンにAMCやrhodamineなどの蛍光物質などを用いて、活性の有無を調べる。
3.インフォマティクス解析によって得られた、USPファミリーDUBの直鎖ユビキチン鎖切断活性に関わるアミノ酸候補について、アミノ酸置換した変異タンパク質を用いて、直鎖状ユビキチン鎖の切断活性の有無の変化について調べる。これにより、USPファミリーDUBの直鎖状ユビキチン鎖切断の分子メカニズムの解明を目指す。
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| Causes of Carryover |
平成30年度は発現量が低かったDUBの発現条件の検討や、新規DUBのクローニングとタンパク質合成、さらには共同研究者によるインフォマティクス解析による、直鎖ユビキチン鎖切断の特異性メカニズム解析や、DUB阻害剤評価系の構築などをメインに行った。そのため、もっとも高額な試薬・消耗品を必要とする二量体ユビキチンを用いた特異性評価アッセイをあまり行っておらず、余剰金が生じた。
平成31年度には、新たにタンパク質合成に成功したタンパク質や、これまでの結果の再現性確認のために、上記の特異性評価アッセイを重点的に行う予定である。また、研究成果を論文として発表するために、共同研究者との研究打ち合わせや、英文校閲費用、論文掲載料などが必要となる。そのため、平成30年度の繰越し金も含めて、平成31年度に使用する予定である。
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