2018 Fiscal Year Research-status Report
Genome editing without DNA double-strand breaks mediated by CRISPR-Cas9 nickases
| Project/Area Number |
17K07263
|
|---|
| Research Institution | Aichi Medical University |
|---|
Principal Investigator |
小西 裕之 愛知医科大学, 医学部, 教授 (20344335)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
兵頭 寿典 愛知医科大学, 医学部, 助教 (40710645)
シバスンダラン カルナン 愛知医科大学, 医学部, 講師 (30557096) [Withdrawn]
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ゲノム編集 / ノックイン / CRISPR/Cas9 / nickase |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、CRISPR/Cas9 nickaseを従来と違う使い方で用いた変異ノックインの手法を考案し、その有用性を検討している。本年度はまず、D10AおよびH840A変異Cas9（それぞれsgRNAの相補鎖・非相補鎖にニックを導入する）のどちらを用いてもこの方法によるノックインが起きることを確認した。この解析は、PIGA遺伝子に変異を持つHCT116細胞株に同遺伝子の野生型配列をノックイン（遺伝子修正）し、フローサイトメーターによってその効率を測定することによって行った。
次に、CD55遺伝子に制限酵素BspHIサイトをノックインし、薬剤選択後にRFLAを行った。その結果、本研究の方法によるノックイン効率はCas9 nucleaseによる従来法と概ね同等であった（予備実験段階と違い、Cas9 nucleaseとの比較を行った）。これにより、PIGA以外の遺伝子においても本研究のノックイン法が有効であることが確認された。
また、本研究の方法でPIGA変異をノックインした後の細胞からゲノムDNAを抽出し、次世代シーケンサーMiSeqを使ってディープシーケンスを行った。その結果、本研究のノックイン法における予期せぬ挿入欠失の発生率は従来法の約20分の1に留まることがわかった。
最近、Cas9 nucleaseを用いたノックインがp53シグナル経路を活性化し、逆に野生型p53はCas9 nucleaseによるノックインを抑制するという知見が報告された。そこで、本研究の方法によってノックインを行った後、p53の下流分子p21をリアルタイムPCRおよび免疫染色で定量的に解析した。また、RNA干渉法によるp53遺伝子の発現抑制下で本研究の方法によるノックインを行った。その結果、本研究のノックイン法とp53との相互干渉はほぼ見られないことがわかった。
以上のように、当該ノックイン法の特性は本研究によって解明されつつある。予期せぬ挿入欠失の発生率が低いことなどから、将来的な臨床医学などへの応用が期待できる有望な技術であると考えられた。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本研究のノックイン法について多面的な解析を行い、それぞれ有意なデータを得ることができた。当該方法で高効率なノックインを行うための条件が絞り込まれつつあると考える。また、手数のかかる次世代シーケンスを本年度中に完遂することができた。得られたデータから、本研究のノックイン法によってノックイン部位に予期せぬランダム異常（挿入欠失）が導入されるリスクは、従来法に比べてはるかに低いことがわかった。研究代表者らが研究計画調書に記した以前からの推論を裏付けるデータであり、これによって本研究のノックイン法の優位性を示すことができた。
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成29年度、PIGA遺伝子、EGFP遺伝子をそれぞれ用いた2種類のアッセイ系において本研究の方法によるノックイン効率の測定を行った。その結果、本研究の方法によるノックイン効率は、PIGA遺伝子の系においてはCas9 nucleaseを用いる従来の方法と概ね同等であった。一方、EGFP遺伝子の系においては従来法よりも劣っていた。
平成30年度には、CD55遺伝子を用いたアッセイ系でも同様の解析を行ったところ、その結果はPIGA遺伝子の系における結果と類似していた。よって本研究のノックイン法の有用性は一応担保されたものと考える。しかし、EGFP遺伝子の系において本研究の方法が十分に機能しない理由は依然として不明なので、その解明に向けた追加実験を今後行う方針である。
また、基本的な検討事項として、本研究で用いるCas9 nickaseがゲノムの一本鎖切断だけを誘導し、二重鎖切断は引き起こさないことを確認する予定である。DNA二重鎖切断が部分的にでも発生していた場合、それが高効率のノックインの原因になっている可能性を否定できないからである。確認の方法としては、細胞にCas9 nickaseを導入した後、Cas9標的部位を含むよう蛍光PCRによる増幅を行い、キャピラリー泳動でPCR産物のサイズを決定してランダムな挿入欠失の有無を判定する（IDAA法）予定である。
また、Cas9 nickaseがプラスミドDNAに結合し、その一本鎖切断を誘導していることも確認する予定である。細胞に導入されたプラスミドDNAは、導入直後には細胞質に存在すると考えられる。核に存在するゲノムDNAとは局在が異なるため、両者に対してCas9 nickaseが同様に作用する保証はない。この点について実験的に検証する。
|
| Causes of Carryover |
（理由）本年度内にノックイン効率測定のために使用したアッセイ系のうち、PIGA遺伝子修正の系や、PIGA変異をノックインにより導入する系（次世代シーケンス解析の際に使用）については、2017年度までに構築したアッセイ系およびプラスミドベクターをそのまま転用して系を構築した。これにより、アッセイ系構築に要する費用を削減し、予定よりも少ない使用額によって研究を実施することができた。
（使用計画）本研究の方法によるノックインの効率がアッセイ系によって異なる理由を2018年度に分析する予定だったが、実際には他のトピックを優先して研究を進めたため、上記のトピックは2019年度以降に解析することになった。いくつかの実験を実施する予定であるが、期待通りに有意な結果が得られるとは限らず、想定以上の実験を要する可能性もある。この解析を完遂するための費用として次年度使用額を利用する予定である。
|
