2017 Fiscal Year Research-status Report
HIV-1の遺伝子発現を保証するための転写とRNA核外輸送との連携
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17K07283
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
谷口 一郎 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (00467432)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | RNA核外輸送 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
レトロウイルス遺伝子は宿主細胞のゲノムに組み込まれており、その発現は細胞の機構に依存する。レトロウイルスに属するヒト免疫不全ウイルス1型（HIV-1）の遺伝子発現では細胞の機構に加えて、ふたつのウイルスタンパク質、転写伸長因子TatとRNA核外輸送因子Revが必要である。これまでに筆者はTatとRevがウイルスRNAの共通の領域に結合することを見出していた。この発見から、TatとRevが複合体を形成してHIV-1遺伝子の転写とRNA核外輸送を密接に連携させると考えた。
本研究では、HIV-1遺伝子発現におけるTatとRevによる連携機構の重要性を解明するため、はじめにTatとRev間の相互作用を調べた。それぞれの組換えタンパク質を大腸菌で発現させ精製し、これら精製タンパク質どうしの相互作用をGSTプルダウンによって解析した。その結果、TatとRevが直接結合することが示された。
次に、TatとRevが協調的に機能するかを調べる目的で、HIV-1プロウイルスから発現するウイルスRNAを模擬するモデルRNAを作製し、TatとRevのモデルRNAへの結合を調べた。TatとRevが直接相互作用することから、TatとRevそれぞれ単独よりも両者そろった場合において、モデルRNAへの結合が増強される、つまり協調的な結合が観察されると予想していた。しかし、実際はTatのモデルRNAへの結合がRevによって阻害され、相互排他的結合であることがわかった。
以上の結果は、TatとRevが協調的に転写とRNA核外輸送を促進するという当初の仮説に反する。むしろ、TatとRevは相互排他的にウイルスRNAに結合することによって、ウイルス感染時期に応じて、ウイルス遺伝子の発現パターンを調節する可能性が新たに考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
HIV-1タンパク質、転写伸長因子TatとRNA核外輸送因子Revによる連携寄稿を明らかにする目的で、ウイルスRNAを模擬するモデルRNAを作製した。このモデルRNAへのTatとRevの結合を調べた結果、当初これらのRNA結合は協調的であると予期していたが、実際は相互排他的であった。したがって、ウイルスの遺伝子発現において、転写とRNA核外輸送とが連携することにより両過程が互いの進行を促進するという当初の仮説を修正する必要に迫られた。
HIV-1の遺伝子発現パターンは感染時期に応じて変動することが知られている。すなわち、初期では完全にスプライシングされたRNAのみが核外輸送されてTatとRevが翻訳される。Tatは転写伸長を促進することでウイルスRNAの発現を増強する（便宜上、この時期を中期とする）。後期ではイントロンを含んだRNAがRev依存的に核外輸送され構造タンパク質が発現する。以上の知見から、Tatは中期において転写だけではなくスプライシング反応を促進する新規活性を有することによってTat自身とRevの発現を誘導し、Revは後期においてRNA核外輸送だけではなくTat活性を阻害する新規活性によってスプライシング反応を抑制して構造タンパク質の発現を誘導する、という仮説を立てた。
仮説の修正を余儀なくされたがこれを証明できれば、HIV-1遺伝子発現が従来考えられていたものよりも複雑で精緻な機構であることの証明につながる。また、次項目「今後の研究の推進方策」に記載の試験管内スプライシング反応系を利用した解析において、修正版仮説を支持する予備的結果を既に得ている。
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| Strategy for Future Research Activity |
ウイルスRNAのスプライシング反応をTatは促進する一方でRevは抑制するかを検証するために、引き続きHIV-1のモデルRNAを利用する。TatとRevそれぞれの精製タンパク質を試験管内スプライシング反応系に添加することによって、モデルRNAのスプライシング反応が促進されるか抑制されるかを調べる。さらに、両者が存在するときに、量比に応じて、促進・抑制が切り替わるかを調べる。期待通りの結果が得られれば、スプライシング反応の促進・抑制の分子機構に迫る。TatによってモデルRNAへの結合が増強する、逆にRevによってモデルRNAへの結合が減弱するスプライシング因子や関連因子を網羅的に同定する。また、TatやRevと相互作用するそれらの因子を明らかにする。
試験管内スプライシング反応系と合わせて、HIV-1プラスミドをヒト培養細胞にトランスフェクションすることによって、ウイルスRNAを発現させる系も利用する。TatとRevの発現によって、スプライシングされるRNA量とイントロンを含んだままのRNA量をRT-PCRによって定量し、スプライシング反応の促進・抑制を調べ、ウイルス遺伝子の発現パターンの切り替わりを検証する。
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Research Products
(4 results)
