2018 Fiscal Year Research-status Report
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17K07285
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| Research Institution | Osaka University |
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Principal Investigator |
小川 英知 大阪大学, 生命機能研究科, 特任准教授(常勤) (20370132)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | オートファジー / 核内複合体 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
近年，遺伝子発現制御に重要である転写制御とタンパク質分解の分子機構であるオートファジーが密接に関与していることは明らかになりつつある。その接点として我々は選択的オートファジーのレセプターであるp62がクロマチン構造変換因子ARIP4に結合し調節することで，細胞外の状態をモニターしてクロマチン構造に反映させるエピジェネティック制御因子であることを発見した。本研究ではこのp62の核内での機能を明らかにするために，p62の核内複合体の精製およびその構成因子の機能解析を通してp62によるクロマチン構造変換およびそれに伴う転写制御機構の解明を目的とする。本年度は昨年度に引き続き，p62の核内複合体の精製によって得られた情報から核内p62に特異的に結合する複合体構成因子の相互作用の確認と，抗体作製，局在確認を行ってきた。核内p62複合体をより精製度を上げて精製するために現在グリセロール濃度勾配による分離を試みている。この手法を用いることで複数の複合体の集合体である場合，それぞれの大きさによって分離することができ，それぞれの分画から再度p62の抗体で精製することでより均一な複合体の精製が可能である。このようなアプローチと共に本年度は構成因子の一つである還元酵素であるPRDXファミリー因子群が核内p62と特異的に結合する因子であることを発見した。抗体を用いた解析で，細胞質p62複合体では非常にすくなく，核内複合体に多く含まれることが判明した。現在この因子群がp62の機能制御にどのように関与しているのか解析を進めている。p62は核内では核内小構造体を形成することが以前の観察から判明している。これらの構造体への複合体構成因子の局在を観察することで，局在と機能の関係を明らかにすると共に，クロマチンとの関与を解明していく予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は，p62の核内複合体の精製のため，核排出阻害剤の処理によるp62の核局在の条件を検討し効果的に核移行した状態でのp62複合体の精製に成功した。二段階精製の段階で精製度の高い複合体の取得に成功し順番に構成因子の同定を行っている。これまでに細胞質の複合体では見られない特異的な因子が数多く検出され，その中には細胞の寿命に関わる因子など，これまでまったく相互作用の知られていない因子との結合が多数検出され，来年度に行う機能解析に非常に興味深い材料がそろった状態である。このように計画にそって順調に進んでいるが，一部構成因子で同定がまだなものが存在するので順次それらについては進めていきたい。
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| Strategy for Future Research Activity |
p62核内複合体のまだ未同定な構成因子が存在するために早急にの同定および，それらの確認を抗体を用いて行う。抗体は購入または受託によって作製することで，そちらに労力を取られない用にしp62複合体の機能解析に優先的に時間を使う。また既知の構成因子においては国内外にその因子の専門家がいる場合が多く，共同研究などを通じてそれらの解析に役立つ資料，資材の調達を行うことで，研究のより早い推進を図りたいと考えている。
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| Causes of Carryover |
北摂の震災によって複合体のタンパク質サンプルおよび複合体を精製するための使用した株化細胞の保存に必須な超低温フリーザーがダメージを受け，さらにその後の猛暑により現在まで非常に温度維持が不安定である。これでは実験資料を適切に保存できないために，旅費と謝金の支出を抑え次年度の予算と合算して新しく超低温フリーザーの購入費に充てる。
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