2017 Fiscal Year Research-status Report

ファンコニ貧血タンパク質とアルデヒド代謝の新たな相互制御関係の解明

Research Project

Project/Area Number	17K07286
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	酒井恒神戸大学, バイオシグナル総合研究センター, 助教 (70526251)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	ファンコニ貧血 / アルデヒド / DNA損傷 / DNA修復 / 脂質代謝
Outline of Annual Research Achievements	これまでの申請者の予備検討において、ファンコニ貧血の責任遺伝子産物の1つであるFANCD2タンパク質と脂質代謝に関連する酵素の1つが直接相互作用することが見出された。しかし、これら二つの因子のどの領域が結合に重要であるか詳細は不明であった。当該年度においてはFANCD2における結合領域を特定するため以下の解析を行った。まず、バキュロウイルス発現システムを用いて昆虫細胞内で野生型FANCD2に加え、様々な領域を欠失した変異型FANCD2を6タイプ（N末端欠失とC末端欠失をそれぞれ3タイプ）それぞれ発現・精製した。一方、脂質代謝酵素は選択的スプライシングの結果として2つのアイソフォームが存在することが知られている。そのためN末端にGSTを融合した各アイソフォームを、前出と同じ発現システムでそれぞれ発現・精製した（いずれの精製タンパク質も期待される分子量であることを確認済みである）。現在これらの精製タンパク質を用いてプルダウンアッセイを行っている。また、FANCD2と単離した脂質代謝酵素は全く異なる機序によって細胞内で制御されているとこれまで考えられており、2つの因子が機能的にどのような相互制御関係にあるのか全く不明である。そこでN末端に蛍光タンパク質を融合した脂質代謝酵素を安定に発現する細胞を樹立し、その細胞内局在を共焦点レーザー顕微鏡でライブセルイメージングによって解析した。その結果、これまで細胞質中のオルガネラに局在し、機能すると考えられていた脂質代謝酵素が、核内にも存在する可能性が新たに見出された。この結果は、申請者の予備検討において脂質代謝酵素の発現抑制によって、DNA損傷の指標となるヒストンバリアントH2AXのリン酸化フォームが有意に増加することと関連する可能性があり興味深い結果である。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 当該年度において、FANCD2と脂質代謝酵素の相互作用領域の特定のためバキュロウイルス発現システム用いて様々な組換えタンパク質の発現・精製を行い、これらを完了させた。これらを利用したGSTプルダウンアッセイについては現在進行中である。
Strategy for Future Research Activity	当該年度において行った解析によって脂質代謝異常とDNA損傷応答・修復の関連が明らかになりつつある。しかし機能的な点については十分な情報が得られていない。そのため今後は脂質研究に詳しい研究協力者らと議論・検討し、研究実地計画に記載されているように、両機構の機能的連関について解析を進める予定である。
Remarks	当該年度に行った研究発表において、第29回ファンコニ貧血研究基金科学シンポジウムでは旅費が全額免除される口頭発表に採択され、また日本環境変異原学会第46回大会ではベストプレゼンテーションに選ばれた。