2019 Fiscal Year Research-status Report
ヒトミトコンドリアDNAホモプラスミー化の分子基盤に関する研究
| Project/Area Number |
17K07294
|
|---|
| Research Institution | Institute of Physical and Chemical Research |
|---|
Principal Investigator |
凌 楓 国立研究開発法人理化学研究所, 環境資源科学研究センター, 専任研究員 (70281665)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | ミトコンドリア / ミトコンドリアDNA複製・修復・分配 / ミトコンドリアDNAの組換え / コンカテマー / ローリングサークル型DNA複製 / ヘテロプラスミー / ホモプラスミー / 活性酸素種 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
ミトコンドリア（mt）DNAが複製・修復し、子孫へ分配していく過程が細胞質遺伝として知られている。約二十年の間に欧米の研究者らが哺乳類動物細胞において複数のmtDNA複製様式を提唱した。我々は出芽酵母において見出した組換え依存型ローリングサークル型mtDNA複製が最も主要な複製様式であることが欧米の研究者らに実証された。最近、ヒト細胞において適量の活性酸素種(ROS)を生成させると新規合成mtDNAがコンカテマーであることからローリングサークル型mtDNA複製がほかのmtDNA複製機構より先に作動することを再度認識した。本年度は、出芽酵母のmtDNA組換え酵素Mhr1のホモログhsMhr1をコードするhsMHR1のノックダウンでヒト胎児肺由来線維芽細胞TIG-3において欠失変異mtDNAによるヘテロプラスミーのレベルがコントロールと比べて顕著に増加することを見出した。欠失変異mtDNAが二本鎖DNA切断から生じるのでhsMhr1が酵母Mhr1と同様に組換え機能を通して二本鎖DNA切断を修復することが考えられる。即ち、hsMhr1がMhr1と同様にmtDNAの完全性維持に働く機能を持つことが示唆された。また、hsMHR1を持つpcDNA3.1 プラスミドをHeLa細胞に導入して発現 させるとmtDNAコピー数が増加したことからコンカテマーを生成するローリングサーク型複製の活性化が起きることが示唆された。さらにhsMHR1を発現させると欠失変異mtDNAと正常mtDNAが双峰分布(bimodal)を示し、欠失変異mtDNAによるヘテロプラスミーのレベルが低く抑えられた細胞の割合が顕著に増加した。これらの結果からヒト細胞においてhsMhr1を介したホモプラスミー形成機構が存在することが示唆された。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
ホモプラスミーの形成は細胞質遺伝、即ち、ミトコンドリアDNA遺伝の基本です。我々が世界を先駆けて出芽酵母において組換え依存型ローリングサークル型mtDNA複製がホモプラスミー形成の基本機構であることを見出しました。その後、欧米の研究者らは出芽酵母においてこれがが最も主要な複製様式であることであると実証しました。しかし、哺乳類動物細胞において複数のmtDNA複製様式が提唱され、組換え依存型ローリングサークル型mtDNA複製に働く因子の同定がまだ成功していない。そこで本提案の実施を通してヒト類縁体hsMhr1は酵母のMhr1に類似した機能を持つことを証明できたことが重要な意義を持つ。また、我々が見出した機構の普遍性を証明することにも繋がりました。一連の研究成果は科研費による絶え間ない支援のお陰です。深く感謝しております。
|
| Strategy for Future Research Activity |
iPS細胞のミトコンドリアDNAはリプログラミングでリセットされないことが知られている。
我々はiPS細胞はミトコンドリアDNAの欠失変異によるヘテロプラスミーであることを確認した。ミトコンドリアDNAの欠失変異が発がんと深く関連している。ミトコンドリアDNAの欠失変異がDNAの二本鎖切断によることと、。組換え能がDNAの二本鎖切断を修復することが一般的に知られている。今後、人為的にhsMhr1を発現させることでミトコンドリアDNAの欠失変異を防ぐことでヘテロプラスミー化を抑えられることが今後の研究の推進方策となる。
|
| Causes of Carryover |
(1)論文の掲載料の支払いに使わなければならない。
(2)hsMhr1の強発現がiPS細胞のヘテロプラスミーを抑えるかどうかを調べる予定である。
その際、C1システムのフリューダイム独自の集積流体回路（IFC: Integrated Fluidic Circuit）内の独立した反応チャンバーを用いて、iPS細胞をシングルセルとして単離する。そして欠失変異mtDNAによるヘテロプラスミーレベルの変動を追跡する予定である。この実験に使用するC1プレートは一枚５万円かかるので残額が結局全部使わなければならない。
|
