Regulation of TSC2 function by reversible acetylation

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07295
• Research Institution: Institute for Developmental Research, Aichi Human Service Center
• Principal Investigator: 川口 禎晴 愛知県心身障害者コロニー発達障害研究所, 発生障害学部, 主任研究員 (00450833)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: TSC2 / 可逆的アセチル化 / 翻訳後修飾 / mTOR

Outline of Annual Research Achievements

TSC2分子の働きを調節するメカニズムとして可逆的アセチル化に着目し、その詳細を明らかにする目的で、本年度は既に我々が同定したアセチル化部位の変異体（アセチル化不全変異体）を用いた性状解析を実施し、一方でその部位のアセチル化に対する特異的抗体をウサギを用いて作製した。
TSC2のアセチル化不全変異体を用いた解析からは、アセチル化はTSC2のリン酸化状態に影響を及ぼし、アセチル化されない場合は特定のリン酸化が低下すること、結果としてTSC2の働きは増強されmTORシグナリングは強く抑制されること（p70S6Kのリン酸化の低下）を見出した。また、抗アセチル化TSC2特異抗体については、アセチル化ペプチドを抗原としてウサギに免疫を行い、血清を採取し抗体を精製した。抗原を用いた吸収実験と前述の変異体を用いて調べた結果、精製抗体に目的の特異性を認めた。続いてこの抗体を用い様々な培養細胞で内在性TSC2のアセチル化を調べたところ、いずれの細胞においてもアセチル化TSC2を確認することができたため、その有用性が確認された。
我々はアセチル化TSC2の脱アセチル化を担う酵素としてHDAC6を候補に考えていた。作製した抗アセチル化TSC2特異抗体を用い、HDAC6遺伝子欠損マウスの組織サンプルにおいて検証を試みたが、想定されるアセチル化TSC2の蓄積は見られなかった。このことから、アセチル化TSC2の脱アセチル化を担う酵素はHDAC6とは別の分子であるとの結論に至った。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

初年度の目標であったTSC2アセチル化不全変異体の性状解析を進めることができ、アセチル化によりTSC2の機能が制御されることを実証できた。一方、アセチル化擬似変異体の作製はまだ得られておらず、作製進行中である。
ウサギを使った特異抗体の作製が完了した。特異性の検証も終えることができた。

Strategy for Future Research Activity

次年度以降は引き続きアセチル化擬似変異体の作製を行い、アセチル化不全変異体と同様に性状解析を実施する。また抗アセチル化TSC2特異抗体を用いて、TSC2のアセチル化不全による活性増強の分子メカニズムを調べる。また、どのような刺激によりアセチル化が亢進するのかを培養細胞を用いて検証する。同時に、可逆的アセチル化を担うプレーヤー（アセチル化酵素と脱アセチル化酵素）の探索を進める。

Causes of Carryover

アルバイトの期間が予定より少なかったこと、旅費の使用がなかったことが主な原因となり次年度使用額が生じた。この金額分は次年度の人件費として使用する予定である。