2017 Fiscal Year Research-status Report
GPCRシグナル調節因子スピノフィリンとGPCRとの相互作用の構造生物学的解析
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17K07301
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
若松 馨 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40222426)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | スピノフィリン / α2Aアドレナリンレセプター / 細胞内第三ループ / NMR / HSQC / titration / 複合体形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全長400残基のスピノフィリン（SPL）のうち71残基のfragmentが（以下SPL-f71），α2Aアドレナリンレセプター（α2A-AR）の細胞内第三ループの19残基のfragment（α2A-AR-f19）と結合することを見いだしていたので，その２つのfragment間の相互作用をNMRで解析する事を試み，以下の知見を得た．
(1) 15NラベルしたSPL-f71のHSQCスペクトルのα2A-AR-f19 titrationと温度変化測定により，SPL-f71のうち20残基がα2A-AR-f19と相互作用していることが，強く示唆された．
(2) SPL-f71の主鎖の構造はα2A-AR-f19との結合により大きくは変化しないことが示唆された．
(3) SPL-f71とα2A-AR-f19との結合は１：１ではない可能性が示唆された．
(4) SPL-f71とα2A-AR-f19とは凝集体を形成しやすいが，choline-O-sulfateの添加である程度抑制されることが分かった．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
SPL-f71とα2A-AR-f19との複合体の構造をNMRで決定するためには両方のfragmentの安定同位体ラベルが必要である．しかし，GSTとの融合タンパク質として発現させたα2A-AR-f19は，様々な培養条件の検討にもかかわらず，収率を上げることができなかった．そこで，発現を諦め，α2A-AR-f19は化学合成品の使用に切り替えた．発現条件の検討で時間がかかったのが，遅れの１つの原因である．
また，SPL-f71とα2A-AR-f19とを混合すると凝集体ができた．この凝集体ができにくい条件を探すのに時間がかかったのが，遅れのもう１つの原因である．
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| Strategy for Future Research Activity |
α2A-AR-f19は塩基性アミノ酸残基が多いので大腸菌にストレスを与え，発現効率が低いと考えられる．そこで，大腸菌にストレスを与えにくい発現系へ変更して，調製する予定である．
SPL-f71とα2A-AR-f19との混合時に生じる凝集体はcholine-O-sulfateの添加である程度防止できるが，完全には防止できていない．申請者の研究室では新規の凝集防止剤を合成しているので，それらも利用して凝集を防止する予定である．
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| Causes of Carryover |
安定同位体試薬の購入を急ぐ必要がなくなったので，繰り越すことにした．次年度の予算に繰越金を合わせて，安定同位体試薬を購入し，ラベルサンプルを調製する予定である．
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