2018 Fiscal Year Research-status Report
GPCRシグナル調節因子スピノフィリンとGPCRとの相互作用の構造生物学的解析
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17K07301
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| Research Institution | Gunma University |
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Principal Investigator |
若松 馨 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40222426)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | スピノフィリン / α2A-AR / 細胞内第三ループ / NMR / 複合体形成 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
全長400残基のスピノフィリン（SPL）のうち71残基のfragmentが（以下SPL-f71），α2Aアドレナリンレセプター（α2A-AR）の細胞内第三ループの19残基のfragment（α2A-AR-f19）と結合することを見いだしていたので，その２つのfragment間の相互作用をNMRで解析する事を試み，以下の成果を得た．
(1) 15NラベルしたSPL-f71，および，そのα2A-AR-f19複合体のHSQCスペクトルの温度変化を比較することにより，SPL-f71のうち20残基がα2A-AR-f19と相互作用していることが，更に強く示唆された．
(2) α2A-AR-f19は細胞毒性があるので，GSTやMBPとの可溶性融合タンパク質は大腸菌では殆ど発現できなかった．そこで，不溶性の融合タンパク質を与えるketosteroid isomerase (KSI) との融合体のコンストラクトを作成した．
(3) 13C-HSQCの感度が低いことが「複合体形成に伴う側鎖のシグナル変化の追跡」を困難にしていたが，感度良く測定できる条件を見出した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
SPL-f71とα2A-AR-f19との複合体の構造をNMRで決定するためには両方のfragmentの安定同位体ラベルが必要である．しかし，GSTとの融合タンパク質として発現させたα2A-AR-f19は，様々な培養条件の検討にもかかわらず，収率を上げることができなかった．そこで，GSTやMBPとの可溶性融合タンパク質としての発現を諦め，不溶性の融合タンパク質を与えるKSIとの融合タンパク質のコンストラクトを作成した．
また，α2A-AR-f19の添加に伴うSPL-f71のNHシグナルの変化が小さいことがα2A-AR-f19とSPL-f71との複合体のストイキオメトリーや結合定数の決定を困難にしていた．α2A-AR-f19は塩基性であるのに対し，SPL-f71は酸性であるので，側鎖の解離基どうしの相互作用が重要で，側鎖のCHは複合体形成に伴って大きく変化すると期待していた．しかし，13C-HSQCの感度が低かったことから複合体形成を13C-HSQCでモニターすることができなかった．年度末に13C-HSQCを高感度に測定する条件を見出したので，今後は13C-HSQCで複合体のストイキオメトリーと結合定数を正確に決定できると期待される．
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| Strategy for Future Research Activity |
従来の融合タンパク質発現系では細胞毒性の強いα2A-AR-f19を効率的に発現できなかったので，化学合成したペプチドを使わざるを得ず，安定同位体ラベルによる詳細な解析ができなかった．不溶性画分として発現するKSI融合タンパク質のコンストラクトを作成したので，今後は不溶性タンパク質として発現させ，安定同位体ラベルして，SPL-f71との結合を解析する．α2A-AR-f19のどの残基がSPL-f71と結合するのか，結合に伴い，どのような構造変化を起こすのかが決定できると期待される．
13C-HSQCスペクトルが感度良く測定できるようになったので，SPL-f71の側鎖CHシグナルの変化を指標として「SPL-f71のどの残基がα2A-AR-f19と相互作用するのか」の情報を得る．
また，熱分析によりSPL-f71とα2A-AR-f19との相互作用のストイキオメトリーと結合定数を決定する．
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| Causes of Carryover |
安定同位体試薬の購入を急ぐ必要がなくなったので，繰り越すことにした．次年度の予算に繰越金を合わせて，安定同位体試薬を購入し，ラベルサンプルを調製する予定である．
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