2019 Fiscal Year Annual Research Report
Structural analysis of the interaction between spinophilin, a GPCR-signaling modulator, with GPCR
| Project/Area Number |
17K07301
|
|---|
| Research Institution | Gunma University |
|---|
Principal Investigator |
若松 馨 群馬大学, 大学院理工学府, 教授 (40222426)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 凝集 / アミロイド / オスモライト / NMR |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
スピノフィリン（SPL）はシナプス後肥厚に豊富に局在するリン酸化タンパク質で，アクチン線維との結合を介して他のタンパク質を細胞膜に局在化させる足場タンパク質の機能を有する．SPLは各種Ｇタンパク質共役受容体（GPCR）と結合し，GPCR kianseと競合するので，GPCRのリン酸化やその後のMAPK活性を阻害する．また，SPLはRGSとも結合することが知られており，SPLはGPCRを介するシグナリングを微調整すると考えられている．しかし，(1) SPLのどのアミノ酸残基がGPCRのどのアミノ酸残基と結合するのか，(2) 結合した時にどのような立体構造を形成するのか，また，(3) それらの相互作用はGPCRに共通なのか・多様性があるのか，などは全く解明されていなかった．
昨年度までの研究で相互作用部位はSPLについては74残基の領域，ADRについては19残基の領域にまで絞り込めていた．どの特定の残基が相互作用するのかは，NMRによる詳細な解析が必要であったが，ADRがアミロイド化しやすい配列を持っていたことから難航していた．本年度は以下の戦略を用いることでアミロイド化や凝集を防止した状態でNMRによる滴定を行うことができた．1) SPL，ADRともにタグ付きタンパク質として扱うこと，2) ADRの濃縮時と滴定時にアミロイド化を防止するcholine-O-sulfateを添加すること，3) アミロイド化を促進する可能性がある化学シフト基準物質を排除し，NMRチューブをシリコナイズすること．特に，SPLに結合させたMBPタグは，MBP由来の余計なNMRシグナルを与えず，SPL部分のシグナルの観測を妨害しなかったことから，不安定なタンパク質のNMR測定には有用であると考えられる．また，上記1-3の戦略は凝集しやすいタンパク質どうしの相互作用解析に一般的に有用であると期待される．
|
