2017 Fiscal Year Research-status Report
酵素基質複合体の構造ダイナミクス解析に基づく反応方向制御機構の解明
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17K07304
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| Research Institution | Kanazawa University |
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Principal Investigator |
瀬尾 悌介 金沢大学, 物質化学系, 助教 (10339616)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 酸化還元反応 / フラビン / 鉄硫黄タンパク質 / 速度論 / 構造ダイナミクス |
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| Outline of Annual Research Achievements |
Ferredoxin(Fd)とNAD(P)+/H間の酸化還元反応を可逆的に触媒するFerredoxin-NAD(P)H酸化還元酵素(FNR)では，基質結合に伴い逆反応を抑制して生理的方向へ反応が進行するように，反応方向が制御される.この制御が酵素基質複合体形成に伴う構造ダイナミクスの変化に起因すると考えられるため，異なる方向性を示すFNRを用いた比較研究と部位特異的変異導入により，制御を実現する構造的要因と制御機構の解明を目指した。
緑色硫黄細菌FNRのC末端部を削除した変異体のFNRとNADP+/H間の前定常状態反応の測定結果は，C末端部がFNR-NADP+複合体を安定化して酸化還元平衡時のFNRの相対的電位の上昇を引き起こし，NADP+還元方向へ反応が進むよう制御していることを明らかにした。
紅色非硫黄細菌FNRとNADP+/H間の酸化還元反応の測定結果は，紅色非硫黄細菌FNRではNADP+/Hとの酸化還元反応が完全に可逆であることを明らかにした．他のFNRでは，NADPH酸化あるいはNADP+還元のいずれか一方向に反応が進行するように，相対的酸化還元電位などが変化するのとは対照的である．過渡吸収スペクトルにおいて，NADP+の結合からCT複合体形成に至る過程で他のFNRと顕著な差が見られたことから，還元型FNRのFADイソアロキサジン環とアミノ酸残基との相互作用が，方向制御の鍵を握ることが推察された．
FNRの補酵素FADのイソアロキサジン環si面には，Tyr残基が必ず存在する．TyrがPheに置換されたFNRホモログを発見し，このFNRホモログ及びsi面のアミノ酸残基をPhe等に置換したFNR変異体を発現・精製した．NADP+/H及びFdとの酸化還元反応を測定した結果は，si面に電子供与能のある芳香族残基の存在がFNR活性に必須であることを示した．
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
アミノ酸配列の比較と生理的機能に基づき，異なる生物種由来の3種のFNRを対象として速度論的研究と酵素基質複合体構造に関する研究を進めた．
緑色硫黄細菌FNRのC末端部を削除した変異体とNAD(P)+/H間の酸化還元反応の測定結果は，C末端部がNADP+還元方向へ反応を進行させることに寄与することを明らかにした．さらに同FNRと同細菌Fdの結合が方向性制御に及ぼす影響を調べるために，同細菌Fdを大腸菌で発現させて精製した．精製Fdの鉄硫黄クラスターは3Fe-4S型であったが，嫌気下での化学的処理により生理的状態である4Fe-4S型に再構成できた．再構成Fd共存下においてNADP+還元速度の大幅な上昇が確認され，三量体形成が速度論的に反応方向制御に寄与することが示唆された．反応機構モデルの作成とその検証のために，基質濃度範囲等の測定条件の検討を進めている．枯草菌FNRを用いて比較研究を実施するために，枯草菌FNR変異体の精製を進めている．
FNRと電子受容体/電子供与体蛋白質との複合体の結晶構造解析を目指し，枯草菌の2つのflavodoxin(Fld)遺伝子を発現し，産物を精製した．枯草菌FNRとFld間の電子伝達活性はFd使用時の約60％を示し，生理的条件下でFNRの電子受容体として機能することが確認された．Fldと枯草菌FNRの複合体結晶化条件のスクリーニングが連携研究者の協力の元で進行している．
部分同位体ラベル試料を用いたNMR分光法によるFNR-基質複合体の構造情報の取得のために，FNR断片とインテインの融合蛋白質の発現系を構築して発現・精製を行った．融合蛋白質は大腸菌内でFADが結合した状態で発現し，アフィニティータグを利用した精製が可能であった．インテインの活性化によるペプチド切断とFNRペプチド断片の結合のための反応条件を検討している．
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| Strategy for Future Research Activity |
反応方向の制御を実現する構造的要因と制御機構の解明を，平成29年度に引き続き3種のFNRを用いて進める．具体的には，野生型及びC末端部のアミノ酸残基に変異を導入した緑色硫黄細菌FNRを用いたFd共存下でのNADP＋/H酸化還元反応の測定と，NADP+/H及びFd存在下での野生型及びC末端部のアミノ酸残基に変異を導入した枯草菌及び紅色非硫黄細菌FNRの反応の測定を行う．酵素基質複合体に関する構造情報が得られた場合，制御機構の詳細を明らかにするために，C末端部へリックスの双極子モーメント，極性残基の電荷，FADにスタックしている芳香族残基のπ電子の相互作用等，どのような因子が複合体構造や方向制御に関与していると考えられるか，該当するアミノ酸残基へ変異導入して検証を行う．
酵素基質複合体の結晶化を連携研究者の協力の元で進める．枯草菌FNRについては，平成29年度に引き続き溶解度がFNRに近いFldを用いて複合体の結晶化条件の検討を進める．緑色硫黄細菌FNRの場合は嫌気下での結晶化が必要であると考えられるため，連携研究者と複合体の結晶化の可否を検討する．
平成29年度に引き続きNMR分光法による構造決定に向けて，蛋白質編集を用いた部分同位体ラベル試料の作成を進める．試料が準備でき次第，NADP+/Hの有無による構造変化の測定を行う．部分同位体ラベル試料で十分な信号が得られて構造が推定可能だと判断された場合，FeをGaに置換したFdの調製にとりかかる．
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