2018 Fiscal Year Research-status Report
癌・幹細胞増殖性維持に関わる翻訳抑制複合体の形成原理と創薬に向けた分子基盤の構築
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17K07307
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
永田 崇 京都大学, エネルギー理工学研究所, 准教授 (10415250)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | Musashi / NMR / RNA結合 / AFM |
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| Outline of Annual Research Achievements |
癌・幹細胞増殖性維持に関わるRNA結合タンパク質Musashi1 （Msi1）はN端領域に２つのRNA結合ドメイン(RBD)、RBD1及びRBD2を有する。今年度は、これらのドメインが連結したRBD1-RBD2に対して種々のRNAの結合解析を行い、NMR及び高速AFMを用いた解析に適したRBD1-RBD2と、複数のRNAの候補を得た。
これまでに、RBD1とRBD2がそれぞれ標的RNA、GUAG及びUAGを認識することを見出し、RBD1:(GUAG)U複合体及びRBD2:G(UAG)U複合体の立体構造を決定することで相互作用様式を明らかにして来た。これまでにもRBD1-RBD2のコンストラクトを作製していたが、今年度は最新の知見に基づいて、N及びC末端を確定しより有効だと考えられるコンストラクトを作製した。RNAに関しては前回UAGXnGUAG (X=U/A/C/G, n=0-50)を分子モデリングにより見出した(Molecules, 2017)。NMR解析用のRNAを得るため、低いn値、n=1のUAGXGUAGを少なくとも１つ含むnumb-15、WUAP、CCNG2等遺伝子由来のRNA及びn=0のRNAを調製し、RBD1-RBD2との結合をゲルシフトアッセイ及び蛍光偏光解消法を用いて解析した。これらのRNAはRBD1-RBD2との結合の解離定数が28-725 nM範囲にあった。さらに、n=2, 3のRNAを用いて同様の解析を行った結果、解離定数が0.3-30 nM範囲となり、RBD1-RBD2との結合に、より適したRNAの候補を得ることに成功した。現在、得られたRBD1-RBD2とRNAの複合体を作製し、NMR立体構造解析を行うところである。他方、高速AFMによるMsi1の探索及び標的配列の認識の観察にもこれらのRNAをはじめn値が大きなものも使って解析する予定である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
昨年度の成果に基づいて、結合解析に適したMsi1のRBD1-RBD2コンストラクトを作製し、標的配列を含むRNAを複数個得た。標的RNA配列UAGXnGUAG (X=U/A/C/G)のうち、n=2,3のものがRBD1-RBD2との結合の解離定数が0.3-30 nM範囲となり、しかも1:1の複合体を形成することがわかった。これらのRNAはRBD1-RBD2との複合体のNMR立体構造解析に適している可能性が高いため、各種NMRスペクトルの品質を確認し、最も解析に適しているRNAを決定する。高速AFMの測定に関しては、一本鎖DNAを固定化したフレームの調製に昨年度成功していた。さらに今年度は、一本鎖DNAに結合し、その上を移動することが出来るコントロールタンパク質を用いて、実際にそのタンパク質が移動するのを観察することに成功した。また、Msi1とは異なるRNA結合タンパク質について、RNAの結合に際して誘導される構造変化を高速AFMで観察することに成功した。このように、高速AFMの測定におけるノウハウは蓄積してきた。現在、RBD1-RBD2の標的配列を含み、上記フレームに固定できる長鎖のRNAの調製を行っているところであり、調製の目処は立っている。
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| Strategy for Future Research Activity |
NMR立体構造解析については、RBD1-RBD2の安定同位体標識を行う。高速AFM観察については、フレームに固定化するRNAの調製を行う。標的RNA配列UAGXnGUAG (X=U/A/C/G)のうちn=2-50のものを、また癌等に関わる遺伝子のmRNAに由来するものを想定している。
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| Causes of Carryover |
今年度は、RBD1-RBD2及び各種RNAの調製、ゲルシフトアッセイ及び蛍光偏光解消法、高速AFM用のフレームの調製、高速AFMの予備実験のためのタンパク質と一本鎖DNAの調製、高速AFMのカンチレバーなどに使用して来た。次年度は、RBD1-RBD2の安定同位体標識、NMR用RNA合成、高速AFM用のRNA調製等をする必要があるため、使用額が生じた。
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