2019 Fiscal Year Annual Research Report
Structural basis for the progression of clathrin assembly in clathrin-mediated endocytosis
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17K07309
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| Research Institution | Kyushu University |
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Principal Investigator |
嶋田 睦 九州大学, 生体防御医学研究所, 准教授 (70391977)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / エンドサイトーシス / X線結晶解析 / 電子顕微鏡 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
クラスリン依存性エンドサイトーシスは真核生物が細胞外から細胞内に物質を取り込む仕組みであり、クラスリンと呼ばれるタンパク質が細胞膜上で格子状に重合するクラスリン重合過程から開始される。本研究は構造生物学的手法と相互作用解析手法を組み合わせて、クラスリン重合過程の進行を担う鍵となるタンパク質群の相互作用の構造的基盤を確立し、クラスリン重合機構を解明することを目的とする。昨年度までにAP-2複合体のα-adaptin appendageドメインとEps15の約60 残基の領域の複合体の結晶構造を決定し、等温滴定熱測定を用いた変異体解析により個々の相互作用部位の結合への寄与の程度を解明した。さらに、脂質膜上でのクラスリン重合を試験管内で再構成し、観察するための実験系の構築にも取り組んだ。また結晶構造や等温滴定熱測定で示唆された個々の相互作用部位の細胞内での意義を検討するための細胞生物学的実験の準備と、これまでと異なるフラグメントを用いた相互作用解析実験のための試料調製も進めた。
今年度は脂質膜上でのクラスリン重合を試験管内で再構成し、電子顕微鏡により観察する実験系の構築を、他の種類のエンドサイトーシスに関与するコントロールタンパク質を用いてさらに進め、成果の一部を論文発表した。またこの実験系に用いるEps15、FCHo1、SGIP1全長の発現をバキュロウイルスを用いた複数種類の細胞株により試みたが、いずれも大腸菌での発現よりも分解が進んだ。そのためバキュロウイルスベクターの種類を変更し、再度発現を試みる予定である。また結晶構造や等温滴定熱測定により示唆された個々の相互作用部位の細胞内での意義を検討するための細胞生物学実験を行い、その結果に基づくさらなる細胞生物学実験を準備している。さらに新しいEps15フラグメントを用いた相互作用解析実験を行い、クラスリン重合モデルの検証も進めた。
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Research Products
(9 results)
