2018 Fiscal Year Research-status Report
Structural analysis of modified NCP using mass spectrometry
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17K07313
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| Research Institution | Yokohama City University |
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Principal Investigator |
明石 知子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 准教授 (10280728)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 蛋白質 / 生体分子 / 分析科学 / 質量分析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、DNAのメチル化、およびヒストンのアセチル化・メチル化の修飾により引き起こされるヒストンテイルを含めたヌクレオソームの構造変化を明らかにするため、複合体を壊さずにイオン化し質量測定するネイティブ質量分析（ネイティブMS）や“形の違い”を解析できるイオンモビリティ質量分析（IM-MS）、水素重水素交換質量分析（HDX-MS）等、質量分析を駆使した構造解析を行っている。修飾ヌクレオソームは様々な長さのDNAを用いてモノ～トリヌクレオソームを調製し、ヌクレオソームコア（NCP）のみならず生体における”beads-on-a-string”を模した状態で解析する。
本研究では、結晶構造解析では得られない情報をネイティブな状態で質量分析により獲得すること、および気相におけるフレキシブルな領域の振る舞いを解析することを目的として研究を進めた。
(1) DNAメチル化酵素M.SssIによるCpGメチル化を質量分析で追跡する手法を確立し、酵素の気質認識の特性解析を行った。(2) (CCG)5の繰り返し配列とWidom601DNAの半分の長さのDNA配列を含む147塩基対のキメラ二重鎖DNAを調製し、これを含むNCPを作製することに成功し、イオンモビリティ質量分析による測定を行った。(3) (ATT)nの繰り返し配列とWidom601DNAの半分の長さのDNA配列を含む147塩基対のキメラ二重鎖DNAを設計し、目的とするDNAのプラスミドの構築に成功した。(4)366塩基対の二重鎖DNAを用いてダイヌクレオソーム (diNCP)を調製し、アセチル化の有無での構造の違いについて、Ｘ線小角散乱や質量分析を用いて解析した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
以下のような実験を行い、成果が得られたため。
(1) 大腸菌発現系でDNAメチル化酵素 M.SssI を調製し、M.SssIによるCpGメチル化を質量分析で追跡する手法を確立した。40、147、366塩基対のDNAで解析した結果、M.SssIでは5’および3’末端近傍のCpGはメチル化されないことが分かった。この結果について国際誌に投稿した。 (2) (CCG)nの繰り返し配列とWidom601DNAの半分の長さのDNA配列を含む147塩基対の二重鎖DNAを設計し調製を検討した。その結果、n=5のキメラDNAを調製でき、これを含むNCPを作製することに成功した。Widom601DNAを用いて調製したNCPとの比較をイオンモビリティ質量分析により行い、学会発表した。(3) (ATT)nの繰り返し配列とWidom601DNAの半分の長さのDNA配列を含む147塩基対の二重鎖DNAを設計し調製を検討した。 目的とするDNAのプラスミドの構築に成功した。(4)366塩基対の二重鎖DNAを用いて2つのヌクレオソームコアがつながったダイヌクレオソーム(diNCP)を調製し、これについてアセチル化の有無での構造の違いについて、Ｘ線小角散乱や質量分析を用いて解析した。
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| Strategy for Future Research Activity |
メチル化を施したdiNCP、および特殊な繰り返し配列を有するDNAからなるNCPについて、ネイティブ質量分析やX線小角散乱での解析を進める。
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| Causes of Carryover |
消耗品の支出が予定より少なかったことと、大型機器の補修のための支出がなかったため。
翌年度は、試薬やDNA合成など消耗品費として支出するとともに、データ解析用ワークステーション（150千円）の購入や大型装置の補修費用として活用する。
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