2019 Fiscal Year Research-status Report
Structural analysis of modified NCP using mass spectrometry
| Project/Area Number |
17K07313
|
|---|
| Research Institution | Yokohama City University |
|---|
Principal Investigator |
明石 知子 横浜市立大学, 生命医科学研究科, 教授 (10280728)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
|
| Keywords | 蛋白質 / 生体分子 / 質量分析 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究では、DNAのメチル化、およびヒストンのアセチル化等の修飾により引き起こされるヒストンテイルを含めたヌクレオソームの構造変化を明らかにするため、in vitroで様々なヌクレオソームを再構成し、これについて複合体を壊さずにイオン化し質量測定するネイティブ質量分析（ネイティブMS）や“形の違い”を解析できるイオンモビリティ質量分析（IM-MS）等の質量分析の手法と、X線小角散乱（SAXS）を用いた構造解析を検討した。
(1) 大腸菌発現系でDNAメチル化酵素 M.SssI を調製し、M.SssIによるCpGメチル化を質量分析で追跡する手法を確立した。40、147、366塩基対のDNAで解析した結果、M.SssIでは5'および3'末端近傍のCpGはメチル化されないことが分かった。この結果について国際誌に発表した。 (2) (CCG)nの繰り返し配列とWidom601DNAの半分の長さのDNA配列を含む147塩基対の二重鎖DNAを設計し調製を検討した。その結果、n=15のキメラDNAを調製でき、これを含むNCPを作製することに成功した。(3) (ATT)の17回繰り返し配列とWidom601DNAの半分の長さのDNA配列を含む147塩基対の二重鎖DNAを調製し、これを含むNCPを作製することに成功した。(4) (2)(3)のNCPについて、ネイティブMS、IM-MS、SAXSおよびサーマルシフトアッセイで解析したところ、601配列のNCPとほぼ同じ構造および物理化学的特性を持つことが示唆された。(4)366塩基対の二重鎖DNAおよびメチル化された同DNAを用いて、2つのヌクレオソームコアがリンカーでつながったdinucleosome (diNCP)の調製を試みた。その結果、調製の過程において凝集しやすく、DNAとヒストンオクタマーを混合後は低濃度に保って各プロセスを行うことが重要であることが分かった。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
メチル化したDNAを用いてdinucleosomeを調製する際、最終段階で凝集してしまうことがわかり、解決策を模索するのに時間がかかったため。
|
| Strategy for Future Research Activity |
メチル化を施したdinucleosomeを調製後、ネイティブ質量分析やSAXS、サーマルシフトアッセイ等での解析を進める。
|
| Causes of Carryover |
計画していた研究のうち、メチル化されたDNAからなるdinucleosome関連の研究において予期せぬ問題が発生し、問題解決を行った後、計画した研究を進めるため。
次年度は滞った研究を進めるための消耗品費として使用することを計画する。
|
