2018 Fiscal Year Research-status Report
非凍結結晶を用いたタイムラプスX線回折測定による酵素反応の解析
| Project/Area Number |
17K07317
|
|---|
| Research Institution | Osaka Medical College |
|---|
Principal Investigator |
村川 武志 大阪医科大学, 医学部, 助教 (90445990)
|
|---|
| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
林 秀行 大阪医科大学, 医学部, 教授 (00183913)
馬場 清喜 公益財団法人高輝度光科学研究センター, タンパク質結晶解析推進室, 主幹研究員 (00437344)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | トパキノン / HAG法 |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本研究は，近年開発されたHAG法（湿度調整と水溶性ポリマーのコーティングを用いたタンパク質結晶マウント法）をさらに発展させ，温度やpHが正確に制御された環境下での結晶内での酵素反応を直接観察することを目的としている．具体的には土壌細菌由来銅含有アミン酸化酵素(AGAO)を材料とし，酸化的脱アミノ反応におけるpH・温度に依存したコンフォメーション変化と，TPQ生合成過程における前駆体Tyr残基から補酵素TPQへの構造変化の2つに焦点を当てる．本年度は酸化的脱アミノ反応中に観察されるコンフォメーション変化機構のメカニズムを明らかにした．
AGAOは，活性中心に補酵素トパキノン(TPQ)および二価銅イオンを含み，第一級アミン類の酸化的脱アミノ反応を触媒する．TPQは前駆体Tyr残基から銅イオン存在下で自己触媒的に生成する．補酵素TPQは銅イオンに配位したOn-Cu型と配位しない構造Off-Cu型の2つの構造をとることが知られており，溶液実験では，On-Cu/Off-Cuの2つのコンフォメーションの割合が温度およびpHに依存することが知られている．このため本年度は， HAG法を用いて，温度およびpHを厳密に制御した環境下でのAGAO反応中間体のX線結晶構造解析を行った．各温度での平衡状態をプロットすることにより，コンフォメーション変化の熱力学的パラメーターを導出することに成功した．さらに，同一温度条件で各pHでの構造を比較することより，構造変化についての重要な知見が得られ，我々がこれまでに提案した反応スキームをさらに拡張できた．
また，二つ目のテーマであるTPQ生合成機構についても，試薬，結晶のサイズなどについての予備的検討を開始している．
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度は研究2年目であり，前年度確立した測定条件に基づき本測定を行った．十分な条件検討と予備測定が行われていたため，比較的早い段階で本測定に成功し，年度後半は論文化に注力し，2018年11月に無事論文がアクセプトされた．
また，二つ目のテーマであるTPQ生合成機構についても，測定を開始している．予備実験の段階であるが良好なデータが得られ始めており，条件が確立次第本測定を開始する．
|
| Strategy for Future Research Activity |
平成30年度で主要テーマのうちの前半部分を完了できたので，二つ目のテーマに本格的に取り掛かる．本年度中に条件検討を完了させ，本測定のための試料を準備する．
|
| Causes of Carryover |
平成30年度は研究費の節約に努めた結果，30万円程度次年度に繰り越せた．これらは主に結晶調製用の試薬および測定施設（SPring-8）までの旅費に使用する予定である．
|
