2018 Fiscal Year Research-status Report

選択的オートファジーを制御する液胞膜因子の構造機能解析

Research Project

Project/Area Number	17K07319
Research Institution	Microbial Chemistry Research Foundation
Principal Investigator	藤岡優子 (野田優子) 公益財団法人微生物化学研究会, 微生物化学研究所, 研究員 (80399964)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	オートファジー
Outline of Annual Research Achievements	選択的オートファジーは，その不全がパーキンソン病などの神経変性疾患の原因となる医学的にも極めて重要な細胞内クリアランス機構である．オートファジーの始動はプレオートファゴソーム構造体（PAS）が担うが，飢餓時のバルクオートファジーと選択的オートファジーとではPASの組成が異なることが知られている．本研究は飢餓時のPAS（飢餓PAS）と比べて理解が遅れている選択的オートファジー特異的に機能するPAS（選択的PAS）について，その特異的構成因子であるVac8を中心とした構造生物学的研究を展開することで，選択的オートファジー始動の分子機構を解き明かすことを目的とする．本年度はVac8-Atg13複合体の結晶化スクリーニングを予定していたが，現在のところ，良好な結晶は得られていない．そこで結晶化と並行して，精製したVac8と人工膜を用いて機能解析実験に着手した． Vac8のN末端は脂質化されることが報告されており，脂質化によって液胞膜に局在し機能するとされている．そこで，Vac8を化学的に人工膜に結合させ，Vac8-液胞のin vitro再構成系を構築した．Vac8を蛍光標識して蛍光顕微鏡観察を行うことで，Vac8が人工膜上に均一に分布することを確認した．次に確立したVac8-液胞再構成系を用いて，Atg因子との相互作用解析を行った．我々は最近，飢餓時のPASの土台であるAtg13-Atg17-Atg29-Atg31複合体がin vitroにおいて液-液相分離し，液滴状になることを発見したが，Vac8-液胞再構成系にその複合体の液滴を添加すると，繋留された液滴は人工膜上を活発に移動し，互いに融合しながら巨大化して最終的に１つの巨大液滴となった．Vac8は液滴状態のAtg因子を液胞膜に繋留する役割を担うことを強く示唆した．
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 3: Progress in research has been slightly delayed. Reason 当初予定していたVac8-Atg13複合体の結晶化と立体構造解析は結晶化の過程で難航している．引き続き結晶化の試みは続けているが，並行して新たにin vitroの再構成研究に着手し，構造情報が得られなくてもVac8の機能の解明に迫れるように研究を展開している．
Strategy for Future Research Activity	本年度明らかになった現象は，飢餓時のPASが液胞上で形成される過程を反映していると考えられ，Vac8は液滴状態のAtg因子を液胞膜に繋留する役割を担うことを強く示唆した．同様のメカニズムが選択的PASの構築にも寄与することが期待される．そこで今後は，選択的PASの土台と考えられるAtg11やその相互作用因子について同様の実験を行うことを予定している．Atg11は精製タンパク質を得ることが大変難しいが，現在発現系の構築を進めている．