蚊媒介性フラビウイルスRNA複製複合体の構造生物学

2018 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07322
• Research Institution: Institute of Physical and Chemical Research
• Principal Investigator: 清水 英明 国立研究開発法人理化学研究所, 生命機能科学研究センター, 研究員 (10360562)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: 複製複合体 / RNA

Outline of Annual Research Achievements

ウイルスRNA複製複合体(replication complex)はウイルス遺伝子複製を担う分子装置であり、その会合は極めて正確な機能遂行において不可欠なプロセスである。本研究ではフラビウイルス科に属するデングウイルスやアルファウイルスのRNA複製の主要酵素であるRNA依存性RNAポリメラーゼを中心に構成される複製複合体の構造解析を実施し、フラビウイルスおよびアルファウイルスにおけるRNA複製の構造基盤を解明することを目的とする。
本年度は巨大な複合体として調製された複製複合体画分について、当センターに設置されているクライオ電子顕微鏡による解析を開始した。デングウイルスについては、N末端とC末端に異なる精製タグを付加することで高純度に精製された複製複合体キメラタンパクを用いて、低分解能ながらもクライオ電顕像を得ることに成功した。複製複合体画分に対し、RNAを添加することによって電顕像コントラストが改善することがわかった。また、良質な結晶が得られた2型、および3型のデングウイルスRNA依存性RNAポリメラーゼNS5について、阻害剤フラグメント複合体のＸ線結晶構造解析を実施して論文投稿（現時点でリバイス中）を行った。アルファウイルスについては、界面活性剤の添加、膜相互作用部位への変異の導入によって複製複合体の安定性が著しく向上し、クライオ電顕による単粒子像を得た。また、別のアルファウイルスの複製複合体各構成タンパク質の遺伝子を合成し、発現系構築を開始した。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

デングウイルス、アルファウイルスのいずれもクライオ電顕による測定が始まり、またRNA添加によって電顕像コントラストの改善がみられたことから、研究期間内に目標達成が期待できる状況である。

Strategy for Future Research Activity

当センターに設置されている電子顕微鏡に用いて、クライオ電顕像の分解能向上を目指す。
新たに報告があった宿主因子との複合体による解析も試みる。

Causes of Carryover

未使用額については前年度までの繰り越し分とクローン合成が想定より低価格で実現したため余剰した。今年度の使用計画についてはタンパク調製、クライオ電顕測定消耗品、データ解析に重点的に充てる予定である。