2018 Fiscal Year Research-status Report
高分解能構造解析によるシトクロムb5還元酵素反応系における電子伝達分子機構の解明
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17K07325
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| Research Institution | National Institutes for Quantum and Radiological Science and Technology |
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Principal Investigator |
平野 優 国立研究開発法人量子科学技術研究開発機構, 高崎量子応用研究所 東海量子ビーム応用研究センター, 主幹研究員(定常) (80710772)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 中性子構造解析 / X線構造解析 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
タンパク質分子間における電子伝達反応機構を理解するためには、それぞれのタンパク質における酸化還元状態調節機構とタンパク質間の電子伝達経路を明らかにすることが重要な課題となっている。酸化還元状態間の構造変化を追跡するためには、タンパク質表面の水分子を含めた全原子構造情報を取得することが必要不可欠であり、電子伝達経路の解明には反応の起こる状態である複合体での構造情報が重要となる。本研究では、哺乳類の肝臓代謝系において脂質合成などに関与するNADH-シトクロムb5還元酵素（b5R）とシトクロムb5（b5）の反応系全体について、X線と中性子それぞれの特長を生かした構造解析を行うことで、水素原子を含めた全原子構造とb5R-b5複合体構造を明らかにし、電子伝達反応において重要な酸化還元状態調節と電子伝達経路の構造基盤を解明することを目的とする。
2018年度は還元型b5Rの高分解能X線構造解析を実施した。野生型と還元型を安定化するT66V変異体について試料調製条件および結晶化条件の検討を行い良質な結晶作製に成功した。放射光X線を利用した回折実験の結果、これまでより高分解能である1オングストローム分解能を越える回折データセットを取得することが可能となった。立体構造精密化の結果、野生型と変異体で全体構造に大きな変化は観測されなかったが、水素移動に重要と考えられる、アミノ酸、補酵素、水分子の立体構造情報を取得することができた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
2018年度は還元型b5RのX線構造解析を実施した。野生型だけでなく還元型を安定化する変異体（T66V）の調製も実施した。酸素存在下で不安定な還元型結晶の作製は無酸素チャンバー内で実施した。また回折能の向上を目指し、再結晶化によるタンパク質純度の向上および結晶化条件の再検討を行い、野生型および変異体どちらについても良質な結晶作製に成功した。大型放射光施設SPring-8のBL44XUビームラインにおいてX線回折実験を行った結果、これまでに得られていた1.3 オングストローム分解能を上回る1オングストローム分解能を超える高分解能の回折データセットを取得することが可能となった。立体構造精密化の結果、タンパク質のアミノ酸残基の一部とタンパク質に結合する補酵素（FADとNAD）の一部について水素原子由来の電子密度を観測することができた。その結果、野生型はNAD+結合状態、変異体はNADH結合状態であることが明らかとなった。野生型と変異体の立体構造を比較したところ、全体構造に大きな変化は見られなかったが、FADおよびNAD(H)結合部位周辺において一部構造変化が観測された。観測された構造変化から、水素移動に重要と考えられるアミノ酸、補酵素、水分子の立体構造情報が明らかとなった。
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| Strategy for Future Research Activity |
2019年度は、b5R一電子還元型、再酸化型の高分解能X線構造解析、還元型の中性子構造解析およびb5R-b5複合体のX線構造解析を行う。b5R一電子還元型および再酸化型の結晶は、まず無酸素チャンバー内で二電子還元型結晶を作製し、酸化剤の添加もしくは酸素暴露により調製する。大型結晶の作製は、種結晶を成長させるシーディング法または酸化型と同様にタンパク質溶液と結晶化溶液を混合し静置するバッチ法により行う。b5R還元型結晶は、液体窒素中もしくは低温窒素気流下で凍結する。大型結晶の凍結が困難な場合は、無酸素チャンバー内でガラスキャピラリーに結晶を封緘する。b5R還元型および再酸化型が結晶中で保持されているかの確認は、顕微分光装置を利用し吸収スペクトル測定により行う。X線回折実験は、放射光施設（Photon FactoryおよびSPring-8）において行う。1オングストローム分解能を超える高分解能X線回折データ収集ができれば、水素原子を含めた立体構造精密化を行う。中性子回折実験は、室温または100 Kの低温で行う。中性子回折実験は、大強度陽子加速器施設J-PARCのiBIXまたは、より強度の強い中性子ビームや単色中性子を利用できる海外の中性子回折装置（アメリカSNS MANDI、ドイツFRM-II BioDiff）において行う。b5r-b5複合体のX線回折データを取得するため、複合体の調製および結晶化は無酸素チャンバー内で実施する。結晶が取得できれば、X線回折実験は放射光施設において行う。
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| Causes of Carryover |
当初購入を予定していた中性子回折実験のための試料調製に使用する重水素化試薬について、購入を取りやめたため次年度使用額が生じた。そのため、次年度分の予算と合わせて重水素化試薬等消耗品の購入を計画している。
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