2018 Fiscal Year Research-status Report
光駆動型ナトリウムポンプ：イオン輸送素過程の解明と機能改変の試み
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17K07326
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| Research Institution | Hokkaido University |
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Principal Investigator |
菊川 峰志 北海道大学, 先端生命科学研究院, 講師 (20281842)
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| Co-Investigator(Kenkyū-buntansha) |
宮内 正二 東邦大学, 薬学部, 教授 (30202352)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | フォトサイクル / ナトリウムポンプ / ナノディスク |
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| Outline of Annual Research Achievements |
ロドプシンは自然界に普遍的に存在する光受容膜タンパク質である。内包する色素レチナールの光異性化反応をきっかけとして、種々の光中間体を経由する光化学反応を示し、その間に機能を発現する。本研究は、近年、真正細菌から見出された外向きNa+ポンプ(NaR)の分子機構解明を目的としている。今年度は、天然環境下でのNaRの光化学反応を明らかにするため、NaRをナノディスクへ挿入した。ナノディスクは、膜骨格タンパク質（MSP）が脂質二分子膜を取り囲んだ円盤状の構造体であり、その中に膜タンパク質を挿入することで、天然に近い環境下にタンパク質を置くことができる。また、ナノディスクは溶液中での分散性が良いため、分光測定にも適している。ナノディスクへの再構成とそれを用いた測定によって、以下の知見を得た。なお、NaRには、アルカリ塩湖から単離された真正細菌Indibacter alkaliphilus由来のNaRであるIaNaRを用いた。
１）IaNaR、MSP、大腸菌脂質を1:1:130のモル比で混合した場合に、最も収量良くIaNaRを再構成できることがわかった。
２）ナノディスクに再構成したIaNaRの光化学反応は、界面活性剤で可溶化した場合とは異なり、７つの速度論的に区別される状態を経ることがわかった。
３）Na+濃度と静水圧を擾乱として用い、光化学反応に現れる変化を観察した。Na+を取り込んでいると考えられるO1,O2中間体は、いずれの条件においても、過渡的な平衡状態を形成しなかった。したがって、O1からO2への移行は不可逆過程であることが示唆された。
４）静水圧を加えるに従って、O1の蓄積量が減少した。O1では疎水的な細胞質側チャネルが水和しており、これによってNa+を取り込み易くなっていると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
NaRを含む複数の微生物ロドプシンの光化学反応は、可溶化処理によって変調されることが知られている。ナノディスクは天然状態の膜タンパク質の性質を調べられる優れた試料である。この試料を用いて、より正確な光化学反応の解析が可能となった。
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| Strategy for Future Research Activity |
NaRは細胞外側表面に、他の微生物型ロドプシンにはない特徴的な構造を複数持つことが分かっている。これらの部位にアミノ酸変異を加え、輸送活性と光化学反応に現れる変化を調べることで、輸送機構の詳細を明らかにしていく予定である。
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| Causes of Carryover |
前年度の研究によって、IaNaRを大腸菌から大量に精製することが可能となっている。そのため、この精製に必要となる高額な界面活性剤の使用を少なくできている。次年度は、遺伝子工学用試薬、大腸菌脂質、蛍光試薬などを多く購入し、効率的に研究を進める予定である。
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