2017 Fiscal Year Research-status Report
筋再生過程におけるN-WASPと膜変形タンパク質による核配置制御機構の解明
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17K07328
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| Research Institution | Chiba University |
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Principal Investigator |
高野 和儀 千葉大学, 大学院理学研究院, 助教 (60466860)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 筋再生 / 周辺核化 / N-WASP / Amphiphysin2 / 核動態 / 膜変形 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
骨格筋の成熟過程は筋再生や筋疾患発症のメカニズムを解明する上で重要な現象である。多核の骨格筋細胞では成熟過程において中心に一列に並んだ核（中心核）が細胞膜直下へと移動するが，その仕組みは不明である。周辺核化が阻害される中心核病の原因遺伝子として膜変形タンパク質 amphiphysin2/BIN-1 (Amph2) が同定されており，アクチン重合因子であるN-WASPと結合する。本研究では周辺核化における N-WASP と Amph2 の役割を解明することを目的としている。今年度はマウス再生筋から得た初代培養骨格筋細胞を3次元培養に供し，詳細な条件検討の結果，培養下において周辺核化を観察することが可能になった。実際に，共焦点レーザー顕微鏡による立体構築画像解析により核動態を調べた結果，培養5日目以降では周辺核化が生じることが観察された。この過程において，アデノウイルスにより発現させた膜変形タンパク質である Amph2 がT菅および周辺核周囲に存在することを確認した。つまり，Amph2 の膜変形活性により生じたT菅が核の移動方向を決めるガイドとして機能することにより周辺核化を制御する可能性が示唆された。これに加え，中心核病の原因となる Amph2 の変異は N-WASP との結合を減弱あるいは消失させることを明らかにした。すなわち，N-WASP は Amph2 と協調して周辺核化に関わることが示唆された。これらの周辺核化における役割をさらに追求する目的で，N-WASP や Amph2 の変異体をコードするアデノウイルスを作製した。一方，骨格筋特異的 alpha-actin プロモーターの制御下において Cre-ERT2 を発現するマウスの作製に着手し，ターゲッティングベクターの構築後，ROSA26 遺伝子座においてこれをノックインさせた相同組換えES細胞クローンを得た。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
生体内で観察される周辺核化を培養化で再現可能とすることが本研究計画の基礎となるが，詳細な培養条件の検討によりこれが可能になったことで現実的かつ順調に今後の研究計画を進められるに至った。また，N-WASPと Amph2 との結合が中心核病の原因となる Amph2 の変異により消失することや周辺核化における Amph2 の興味深い局在は本研究の着眼点および本研究計画を大いにサポートする結果であるため，本研究は概ね順調に進展しているといえる。一方，本研究で使用する材料はその都度用意する必要があるがこれにおいても実験および解析と同時進行で進んでおり，今後の研究計画を遂行させる上で支障はない。
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| Strategy for Future Research Activity |
確立した初代培養筋芽細胞の3次元培養条件下において，野生型の N-WASP や Amph2 あるいはその変異体を発現するアデノウイルスを用いて周辺核化におけるこれらの分子動態やその役割を経時的な顕微鏡観察および3次元立体構築画像の解析により明らかにする。さらに，昨年度の研究により得られた相同組換えES細胞を用いて今後は筋特異的 alpha-actin プロモーターの制御下で Cre-ERT2 を発現するマウスを作製し，すでに得られている N-WASP cKO マウスと交配させることにより，骨格筋特異的かつ筋再生時において周辺核化が起こる前にN-WASPをノックアウトし，生体内における筋再生あるいは上記と同様に初代培養骨格筋細胞の3次元培養に供することにより周辺核化における影響を確認する。これらの解析により N-WASP や Amph2 の周辺核化における役割を明らかにしていく。
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