2018 Fiscal Year Research-status Report

筋再生過程におけるN-WASPと膜変形タンパク質による核配置制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	17K07328
Research Institution	Chiba University
Principal Investigator	高野和儀千葉大学, 大学院理学研究院, 助教 (60466860)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	筋再生 / 周辺核化 / N-WASP / Amphiphysin2 / 核動態 / 膜変形
Outline of Annual Research Achievements	骨格筋の成熟過程は筋再生や筋疾患発症のメカニズムを解明する上で重要な現象である。多核の骨格筋細胞は成熟過程において中心に一列に並んだ核（中心核）が細胞膜直下へと移動する周辺核化が起こるが，その仕組みは不明である。周辺核化が阻害される中心核病の原因遺伝子として膜変形タンパク質 amphiphysin2/BIN-1(Amph2) が同定されており，アクチン重合因子であるN-WASPと結合する。本研究では周辺核化における N-WASP と Amph2 の役割を解明することを目的としている。今年度はまず，マウス再生筋より摘出した初代培養骨格筋細胞をマトリゲルを用いた3次元培養に供したのち，アデノウイルスにより発現させた Amph2 と N-WASP の分子動態を共焦点レーザー顕微鏡により観察を試みた。Amph2 は T管に局在しており，核の移動方向を決めるためのガイドとなる可能性が示されたほか，N-WASP とも一部分で共局在する様子を確認することができた。さらに，中心核病の原因となる Amph2変異体を用いたところ，N-WASP との共局在を減少させることを明らかにした。すなわち，Amph2 の変異によりN-WASPを局在化させられないことが中心核病の原因である可能性が考えられた。そこで，中心核病の原因となる Amph2 の変異がN-WASP-Arp2/3 complex によるアクチン重合活性に与える影響を検討したところ，野生型Amph2 に比べて Amph2変異体では N-WASP-Arp2/3 comlex によるアクチン重合の促進が抑制された。したがって，N-WASP は Amph2 と協調して周辺核化に関与する可能性が考えられた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 今年度に生体内で観察される周辺核化においてN-WASPとAmph2の分子動態を観察できたことは，昨年度の培養条件の検討が生きており順調に進められている。さらに，中心核病を引き起こすAmph2変異体がN-WASPの局在と活性を抑えることは周辺核化の原理を理解する上で大変興味深く本研究の着眼点および本研究計画をサポートする結果となっているため，本研究は概ね順調に進展しているといえる。
Strategy for Future Research Activity	生理的なN-WASPとAmph2の分子動態と周辺核化を関連づけるために，初代培養筋細胞の周辺核化の様子をライブセルイメージングにより検出する。それに加えて，生体内での周辺核化についてN-WASP，Amph2の役割を検討するために，遺伝子改変マウスの作製を引き続き行いつつ，in vivo electroporationにより筋肉に直接プラスミドDNAを導入してcDNAやshRNAを発現させることにより，N-WASPとAmph2の周辺核化における役割を明らかにしていく。