2018 Fiscal Year Research-status Report
宿主内で活性化する細菌遺伝子発現制御系と食細胞を介する感染調節
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17K07331
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| Research Institution | Sapporo Medical University |
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Principal Investigator |
白土 明子 札幌医科大学, 医療人育成センター, 教授 (90303297)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | 自然免疫 / 感染症 / 大腸菌 / 二成分制御系 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
宿主に侵入した細菌は，宿主環境にさらされる。細菌はこれを環境変化として感知して，宿主免疫に抵抗するとともに感染維持や毒性に働く物質の産生を調節する。本研究は，大腸菌の情報伝達経路である二成分制御系と，RNA合成酵素のシグマサブユニットによる感染調節の仕組みを明らかにすることを目的として進められている。
本年度は，初年度の成果に基づき，二成分制御系EnvZ-OmpRによる宿主毒性調節に働く物質の同定を目指した。膜型ヒスチジンキナーゼEnvZが活性化すると，転写調節因子OmpRの活性を変化させ， OmpRが制御下遺伝子群の発現を調節する。このうち正に制御される遺伝子群の中から，ショウジョウバエ宿主感染系を利用して，膜タンパク質をコードするompC遺伝子がハエへの毒性を抑制することを見出してきた。ompC遺伝子欠損菌株の破砕液を出発材料として，遠心分離により細胞質画分，外膜画分，内膜画分を得て活性を調べると，外膜画分に活性が存在した。そこで，外膜画分を界面活性剤で可溶化してクロマトグラフィーにより連続分取を行い，全画分の毒性活性をハエ感染系により調べた。活性の高い画分に含まれるタンパク質をMS解析すると，ompC欠損により存在レベルが高い種類が数十種類見出された。これらのタンパク質をコードする遺伝子群をスクリーニングし，ompC欠損による毒性亢進を担うタンパク質の候補群が得られた。その多くは外膜に局在する機能未知のタンパク質であり，これらの中に，毒性物質が含まれると考えられた。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
2年度目は，初年度の成果に基づき，EnvZ-OmpRに制御されるOmpCタンパク質により抑制されている毒性物質の同定を目指した。研究代表者は，2018年度途中に所属が変わり，新たに研究室の立ち上げを行ない，実験室整備は，実験台や実験機器をいちから準備また調達する時間が必要であった。また，震災停電の影響を受け，試薬類や実験材料の再調製を行なった。そのため，実験の進行が当初予定よりやや遅れている。ただし，OmpC欠損菌株に含まれる毒性成分を，クロマトグラフィーにより分離した全画分の活性を，同じ手順で分離した親菌株の該当画分と比較することで，OmpC介在性の毒性活性画分を追跡できた。また，両菌株由来画分に含まれるタンパク質の比較により，目的タンパク質の候補を効率よく絞り込むことができたことから，来年度の研究で研究進行を推進することが期待できる。
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| Strategy for Future Research Activity |
今後は，これまでの解析で得られた成果に基づき，OmpCにより抑制される毒性物質の同定を目指す。候補タンパク質をコードする遺伝子のそれぞれについて，遺伝子変異菌株を準備する。また，それぞれの候補タンパク質の強制発現を誘導するプラスミドを準備し，これを導入した発現誘導株も作成し，効率よく目的タンパク質を発現する培養条件を整える。発現誘導株は誘導条件や発現効率がそれぞれ違うと考えられるため，まず，遺伝子欠損菌株群の抽出液を調製し，ハエを用いて宿主毒性が減弱する種類をスクリーニングする。ここで選ばれた遺伝子について，続いて，強制発現株の抽出液を用いたスクリーニングを行い，注入実験発現なしと高発現時の宿主毒性の変化をハエ感染系で調べ，候補を絞り込む。続いて，毒性画分を分離精製した手順を利用して，候補分子を分離精製し，これらについてハエへの毒性を調べて大腸菌の宿主傷害物質を同定する。
一方，シグマ因子による感染調節については，その転写後調節に働く分子を，低分子RNAやRNA結合タンパク質の中から見出し，RNA合成酵素による感染調節機構を明らかにすることを目指す。
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| Causes of Carryover |
所属変更のため，必要な機器類が揃わず，予定していた実験の一部を実施することができなかった。また，実施できた実験については，前年度の試薬等が利用できた。次年度の使用系買うとして，EnvZ-OmpR経路により抑制される毒性物質の同定を目指し，候補タンパク質の発現系の最適化やその精製と同定に用いる試薬類，および小器具類，の購入を予定している。
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Research Products
(6 results)
