2018 Fiscal Year Research-status Report
GPCRダイマーのシグナル生成モデル：生細胞１分子観察法による検討
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17K07333
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
笠井 倫志 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 助教 (20447949)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ダイマー形成 / G蛋白質共役型受容体 / 蛍光１分子観察 / リガンド刺激 / 動的 / 人工ダイマー |
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| Outline of Annual Research Achievements |
リガンド結合とダイマー形成が共同的に働く事で、G蛋白質共役型受容体(GPCR)がシグナルを生成するという作業仮説の検証を引き続き進めた。GPCRの動的なモノマー・ダイマー変換の意義を検討するために、人工的に、安定ダイマー形成を誘導することを目指した。そのため、まず、複数の会合体形成誘導法について、蛍光１分子観察法でも利用可能かどうかを調べ、その結果、FKBP/FRB/rapamycinシステムを用いることにした。すなわち、FKBPとFRBは、rapamycin(rapamycinアナログ)存在下でのみ、１：１で結合する分子複合体を形成することが知られており、蛍光1分子観察によってもこうした会合体誘導を観察することができた。そこで、まず、このFKBPおよびFRBをGPCRのC末側に結合させた改変受容体、B2AR-FKBPと、B2AR-FRB（B2AR, β２アドレナリン受容体）をそれぞれ作製した。また、これら2つの改変受容体を、同じ細胞に効率的に共発現させるため、2Aペプチドという自己切断型ペプチド配列を用いた発現ベクターを用いた。そこで、これら2つの改変受容体を、同じ細胞内に発現させ、rapamycinアナログ添加による人工安定ダイマーの誘導が可能かどうか、蛍光１分子観察法を用いて調べた。その結果、rapamycinアナログ添加によって、人工的な安定ダイマー形成を誘導することに成功した。ただし、ダイマーの誘導効率が低いので、より効率的に人工ダイマーが誘導できる条件の検討を進めている。具体的には、GPCRとFKBP、もしくはFRBとをつなぐリンカーの長さを長くする、共発現効率を上げる、rapamycinアナログの添加量や時間の最適化等を行う。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
GPCRの動的なダイマー・モノマー変換の意義を調べるために、人工的に安定ダイマー形成を誘導し、ダイマー・モノマー変換のダイナミクスを制御して調べる。そのため、まず、過去に報告のあった、複数の会合体形成誘導法について、蛍光１分子観察法でも利用可能かどうかを調べた。すなわち、通常の落射蛍光観察時と比べて低い発現量でも、シグナル量の変化をS/Nよく観察できる手法を検討し、FKBP/FRB/rapamycinシステムを用いることにした。そこで、FKBR、もしくはFRBをGPCRの細胞内C末側に結合させた改変GPCRである、B2AR-FKBPと、B2AR-FRBをまず作製した。GPCRは、β２アドレナリン受容体(B2AR)を用いた。これらを同じ細胞に効率よく共発現させるため、自己切断型ペプチドである２Aを介して、二つの分子を一つの発現ベクターに組み込んで用いた。また、ダイマー形成は、GPCRに標識した蛍光色素1分子の蛍光強度の時間変化を追跡し、輝度の階段的退色の回数によって確かめた。その結果、rapamycinアナログ添加時のみ、二段階で退色する蛍光1分子の輝点を観察することができた。すなわち、人工的安定ダイマーの形成を誘導することに成功した。ただし、人工的ダイマーの誘導効率が低いので、高効率でダイマー化誘導ができるよう、リンカー長の調整、共発現効率の調整、rapamycinアナログの添加量と時間などの調整を行っている。具体的には、リンカー長については、FKBP/FRB/rapamycinの分子複合体の大きさと、GPCRダイマーの大きさを考えて適切な長さになるようにする。また、共発現の効率を上げるためには、分子の配列や組み込みの順番を変えたり、シグナルペプチドを変えるなどの方法を検討したりする。
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| Strategy for Future Research Activity |
FRKB/FRB/rapamycinシステムを用いた、人工安定ダイマーの誘導には成功したが、誘導効率が低い。これを改善するため、GPCRとFKBP、もしくはFRBとをつなぐリンカーの長さの調整、共発現効率の調整、rapamycinアナログの添加量や時間の最適化等を行う。また、人工安定ダイマーの寿命の定量を行い、動的なダイマー形成のダイナミクスがどのように制御されるか、その程度を調べる。
高効率で人工安定ダイマー形成を誘導したのちに、活性化した受容体を１分子毎にラベル可能なナノボディと人工安定ダイマーとの二色同時蛍光１分子観察を行い、人工安定ダイマーの活性化状態を調べる。また、二色同時蛍光1分子観察を用いて、人工安定ダイマーへの三量体G蛋白質のリクルート頻度や結合時間の測定、リガンド添加前のcAMP産生量を調べる実験などと組み合わせて、動的なダイマー・モノマー変換の意義の解明を目指す。具体的には、ダイマー形成と受容体の活性化がどのように関連するかを調べることで、動的なダイマー形成がリガンド添加前のGPCRの基礎活性の産生に必要であるという作業仮説を検証する。
次に、人工安定ダイマーを誘導したうえで、リガンド添加後のシグナル産生を調べるなど、上記と同様の実験を行い、リガンドシグナル生成における、ダイマー・モノマー変換の意義、特に、動的なダイマー形成の意義の検証を進める。リガンド結合と動的なダイマー形成が組み合わされることで、リガンドシグナルが生じるという仮説を検証することで、リガンド刺激とダイマー形成が共同して生じるシグナル生成の仕組みを解明する。
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| Causes of Carryover |
物品購入の都合で、残金が1円生じてしまった。翌年度分と合わせて適切に使用する。
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