Identification of the vesicular ascorbic acid transport system

2017 Fiscal Year Research-status Report

• Project/Area Number: 17K07336
• Research Institution: Okayama University
• Principal Investigator: 表 弘志 岡山大学, 医歯薬学総合研究科, 准教授 (10273707)
• Project Period (FY): 2017-04-01 – 2020-03-31
• Keywords: アスコルビン酸 / ビタミンC / トランスポーター / ノルアドレナリン / シトクロムb561

Outline of Annual Research Achievements

アスコルビン酸は分泌小胞内に蓄積し、ノルアドレナリンやコラーゲンの合成に利用される。しかし、このアスコルビン酸がどのようにして小胞内に取り込まれるかは不明である。申請者は酸化型のデヒドロアスコルビン酸が小胞内に輸送され、小胞内で還元される事でアスコルビン酸になるものと考えた。既に小胞型デヒドロアスコルビン酸トランスポーター候補を単離しており、このトランスポーターがシトクロームb561とともに働きアスコルビン酸トランスポーターとして働いている事を解析する。
マウスおよびヒトのデヒドロアスコルビン酸トランスポーターをバクテリアで大量発現する系を作製し、精製した。また、シトクロームb561タンパク質を同様にバクテリアで大量発現し、精製した。
デヒドロアスコルビン酸トランスポーターの輸送活性を測定するために、リポソーム再構成系を構築し、グルコースを基質とした輸送活性の測定系の構築に成功した。現在、このトランスポーターの輸送機能の生化学的解析を行っている。

Current Status of Research Progress

2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.

Reason

マウスおよびヒトのデヒドロアスコルビン酸トランスポーターをバクテリアで大量発現する系を作製し、Ni-NTAカラムクロマトグラフィーで精製した。また、シトクロームb561タンパク質を同様にバクテリアで大量発現し、精製した。精製したb561はヘム含有量が少なく、アスコルビン酸の酸化活性は低かったが、精製時にヘムを添加する事で高い活性のあるものを得る事ができた。
デヒドロアスコルビン酸トランスポーターの輸送活性を測定するために、リポソーム再構成系を構築し、反応時間、リピド量、再構成条件、反応条件等を検討した。その結果、グルコースを基質とした輸送活性の測定系の構築に成功した。現在、このトランスポーターの輸送機能の生化学的解析を行っている。

Strategy for Future Research Activity

リポソームを用いてデヒドロアスコルビン酸の輸送活性を測定する。また、膜小胞を用いて、輸送活性を測定すると同時に阻害剤感受性やキネティクスが精製タンパク質のものと同一か検討する。
培養細胞を用いてRNAi実験を行う。

Causes of Carryover

本年度は順調に研究が進展したが、デヒドロアスコルビン酸を用いた活性測定はしていないため一部余剰が生じた。この測定は次年度行う予定である。
次年度以降は引き続き生化学解析を行うが、抗体購入、アスコルビン酸のアイソトープ、細胞培養費用、トランスポーターおよびb561精製のための界面活性剤の購入に経費を充当する。