2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K07348
|
|---|
| Research Institution | Tokyo University of Pharmacy and Life Science |
|---|
Principal Investigator |
若菜 裕一 東京薬科大学, 生命科学部, 助教 (90635187)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | オルガネラ膜接触 / 小胞体 / ゴルジ体 / 小胞輸送 / コレステロール |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
私たちは以前、小胞体とゴルジ体の膜接触部位におけるコレステロール及びセラミドの輸送が、トランスゴルジネットワーク（TGN）からのCARTS輸送小胞の形成に必要であることを報告した。これら脂質の輸送は、CARTSが担うTGNから細胞膜への小胞輸送と協調して厳密に制御される必要があるが、その分子メカニズムはこれまで明らかになっていない。私たちは、小胞体にコレステロールが十分存在する時、小胞体膜に局在するSCAPというタンパク質がゴルジ体との膜接触部位において、Sac1脂質ホスファターゼを介し、VAP/OSBPからなるコレステロール/ホスファチジルイノシトール4-リン酸（PI4P）交換輸送複合体と相互作用することを見出した。小胞体膜のコレステロールセンサーであるSCAPは、コレステロール欠乏時に膜結合型転写因子であるSREBPを小胞体からゴルジ体へと輸送し活性化することにより、コレステロールの合成・取り込みに関わる遺伝子の転写を促進することが明らかになっている。SCAPの発現抑制は、PI4Pのターンオーバーを阻害し、VAP/OSBP複合体の分布を変化させたことから、小胞体-ゴルジ体接触部位での脂質輸送を阻害している可能性が示唆された。この結果と一致して、SCAPの発現抑制は小胞体-ゴルジ体接触部位の脂質輸送を阻害した時と同様にTGNからのCARTS形成を阻害した。このフェノタイプは、野生型SCAPの発現によりレスキューされたが、コレステロールとの結合によるコンフォメーション変化が誘導されないSCAP変異体ではレスキューされなかった。これらの結果は、小胞体にコレステロールが十分存在する時、SCAPが小胞体-ゴルジ体接触部位でのコレステロール/PI4P交換輸送を介してTGNからの輸送小胞形成を制御することを示唆しており、SCAPの全く新しい機能を示している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
APEXタグ法で見出された小胞体-ゴルジ体接触部位の新規構成タンパク質、ATP6V0A2の機能解析を進めるため、抗ATP6V0A2ポリクローナル抗体を作製した。また、ATP6V0A2の安定発現抑制細胞を樹立した。SCAPの機能解析については以下の進展があった:（1）SCAP安定発現抑制細胞を樹立し、この細胞をもとに各種SCAP変異体安定発現細胞を樹立した。（2）BiFC法を利用したVAP-OSBP複合体可視化細胞を樹立した。（3）上記(1)、(2)の細胞を用いて、PI4Pターンオーバーおよび、VAP-OSBP複合体分布、CARTS形成へのSCAPの関与を明らかにした。（4）精製タンパク質を用いてSac1のPI4Pホスファターゼ活性測定実験系を構築した。（5）ショ糖密度勾配遠心分画法によりゴルジ体膜を単離し、コレステロール含有量を測定した。
|
| Strategy for Future Research Activity |
・コントロール細胞およびSCAP安定発現抑制細胞からショ糖密度勾配遠心分画法によりゴルジ体膜を単離し、コレステロール含有量を測定したが、有意な差を検出することができなかった。現時点で得られたサンプルには、小胞体膜やエンドソーム膜の混入が多く、これが原因となっている可能性がある。さらにゴルジ体の精製度の高いサンプルを調製してコレステロールの測定を再度行う。
・精製タンパク質を用いることでSac1のPI4Pホスファターゼ活性を測定することには成功したが、この実験系ではSCAP（およびSCAPとコレステロールの結合）がSac1活性に及ぼす影響については十分に評価できないため、ミクロソームを用いた実験系の構築を行う。
・小胞体にコレステロールが十分存在する時、SCAPはSREBPおよびInsigと複合体を形成することから、SCAPがこれらタンパク質との複合体として小胞体-ゴルジ体接触部位で機能しているかどうかを検証する。
・VAP-OSBP複合体可視化細胞を利用し、CARTS形成時のVAP-OSBP複合体の挙動（つまり、小胞体-ゴルジ体接触部位のダイナミクス）を観察し、この膜接触部位によるCARTS形成の時間的・空間的制御のメカニズムを解明する。
・樹立したATP6V0A2発現抑制細胞を用い、小胞体-ゴルジ体接触部位における機能解析を行う。
|
Research Products
(5 results)
