2018 Fiscal Year Research-status Report
酵素合成コンドロイチン硫酸のナノ粒子複合体の調製と，CS受容体の探索と機能解析
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17K07352
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| Research Institution | Aichi Medical University |
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Principal Investigator |
杉浦 信夫 愛知医科大学, 分子医科学研究所, 准教授 (90454420)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | コンドロイチン硫酸 / グリコサミノグリカン / GAG受容体 / PTPRσ / ナノ粒子 / 熱帯熱マラリア / VAR2CSA / リポソーム |
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| Outline of Annual Research Achievements |
本研究代表者が構築したコンドロイチン硫酸（CS）およびヘパラン硫酸（HS）糖鎖ライブラリーを用いて、各種グリコサミノグリカン（GAG）結合生理活性分子との相互作用解析解析を行ってきた。昨年度から今年度にかけて、脊髄損傷にも関連する神経細胞のGAG受容体であるタンパク質チロシンホスファターゼ受容体シグマ（PTPRσ）の組換えタンパク質と、固相化合成CS/HS誘導体ライブラリーとの親和性解析を表面プラズモン測定装置（ビアコア）を用いて解析を行った。さらにPTPRσを発現させた培養細胞への蛍光標識CS/HSライブラリーの相互作用を蛍光顕微鏡で観察し、PTPRσ発現神経細胞への培養皿固相化CS/HSリン脂質誘導体による神経軸索進展の効果を解析した。これらの結果をまとめて学術雑誌 J. Biochem. 誌に投稿し、受理・公開された。
熱帯熱マラリアの病原体であるマラリア原虫が産生し、その感染赤血球の表面に出現する膜タンパク質VAR2CSAは胎盤血管（絨毛）細胞表面のCSプロテオグリカン(PG)に結合する。そして、マラリア原虫感染赤血球は胎盤内に潜伏して、体内の防御機構から逃れるため、患者（妊婦）の病態は悪化・長期化する。本研究代表者はVAR2CSA組換えタンパク質と酵素合成CSライブラリーを利用して、VAR2CSAと固相化CS-PGとの結合を強く阻害するCSA20糖鎖を見出した。このCSA糖鎖を利用して、マラリア原虫感染赤血球に対抗できるナノ粒子の創製を試みている。CSA20とリン脂質との結合体を化学合成し、別途調製した脂質リポソームに導入して、CSA-リポソーム型ナノ粒子を調製した。このCSA-リポソームは単独遊離のCSA20糖鎖よりも、VAR2CSAタンパク質の固相化CSAに対する結合を、約600倍強く阻害した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
（１）酵素合成CS/HSライブラリーを用いた神経細胞GAG受容体PTPRσとの親和性解析、およびCS/HSリン脂質誘導体による神経細胞軸索伸展への影響の結果は、学術雑誌 J. Biochem. 誌に発表した。神経細胞に対するCS構造の重要性を示す成果が得られた。
（２）マラリア原虫が産生し、感染赤血球表面に出現する膜タンパク質VAR2CSAと強い相互作用を示すCS糖鎖が、A構造を70%含む平均二十糖鎖長のオリゴ糖鎖CSA20であることを見出した。そのCSA20の還元末端にリン脂質（ホスホエタノールアミン, PE）との結合体（CSA-PE）を還元アミノ化法により化学合成した。別途、リン脂質（ホスホコリン, PC）とコレステロール（Cho）からなる脂質リポソームを調製し、そのリポソームにCSA-PEを導入したナノ粒子 CSA-リポソームを作製した。CSA-リポソームは粒子径が揃い、安定なナノ粒子であった。
（３）CSA-リポソームは単独遊離のCSA20糖鎖に比べ、VAR2CSAと固相化CSAとの結合活性を焼く600倍強く阻害した。これは、今後の抗マラリア剤開発への大きな礎となり得る。
以上、研究目標に対して、研究の進捗は順調に進んでいる。
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| Strategy for Future Research Activity |
（１）CSA-リポソームにおいて、CSA含量や粒子径およびリポソーム含有脂質などを変化させて、CSAのVAR2結合阻害効果やリポソームの安定性などの影響を測定する。そして、ナノ粒子製剤としてより適したCSA-リポソームの調製方法を確定する。
（２）CSA-リポソームに蛍光分子を封入する方法を検討し、その蛍光標識CSA-リポソームを用いて細胞との親和性解析や血中安定性および動物へ投与した時の血中動態・組織移行性などを測定する。
（３）CSA-リポソームに低分子抗マラリア剤を封入する方法を検討し、その抗マラリア剤封入CSA-リポソームの調製方法を確立する。VAR2CSA発現マラリア原虫感染赤血球をCSA産生細胞によって選別し、感染株を樹立する。その感染赤血球を使って、CSA-リポソームによる固相化CSへの結合阻害活性の測定と、抗マラリア剤封入CSA-リポソームによる感染阻害効果・マラリア原虫への攻撃作用を測定する。これらにより新たな抗マラリア製剤開発への基盤とする。
（４）GAG受容体PTPRσは中枢神経系のみならず、筋シナプス接合部などの末梢神経系や、抗原提示などにおける免疫細胞系においても重要な役割を担っていることがわかってきた。これら末梢のPTPRσ受容体にもCSやHSが機能調節に働いていると考えられる。例えばPTPRσを発現している樹状細胞などの免疫細胞の抗原提示作用や活性化機構、サイトカイン類の分泌刺激作用において、PTPRσの発現状況とCS/HS糖鎖ライブラリーを用いて相互作用を解析する。
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| Causes of Carryover |
未使用残額が生じた。次年度の物品費（消耗品費）として使用する。
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