2017 Fiscal Year Research-status Report
硫酸化糖鎖の合成制御機構の解明と制御機構を利用した細胞機能の制御
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17K07353
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| Research Institution | Kobe Pharmaceutical University |
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Principal Investigator |
灘中 里美 神戸薬科大学, 薬学部, 講師 (60378578)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | プロテオグリカン / グリコサミノグリカン / コンドロイチン硫酸 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
硫酸化糖鎖は発生過程や成熟後の細胞機能の制御や恒常性の維持において多彩な機能を発揮する重要な分子であり, 硫酸化糖鎖の機能はその構造多様性を基盤とする.発生プログラムの制御下あるいは環境からの刺激を受け,その時・その場に適した糖鎖構造が合成され細胞機能が制御されると考えられているが, 状況に応じて糖鎖構造が制御される仕組みの詳細は不明である. また, このような生合成制御機構の破綻は細胞機能の異常を引き起こし, 種々の疾患と関連することが予想される. 本研究では以下の３点を明らかにする. ①細胞内外の状況(特に糖鎖の合成状況)を反映し, 場面に応じた糖鎖構造を合成する制御機構の存在を明らかにする ②糖鎖合成制御機構の生理的意義を示す. ③糖鎖構造の合成制御機構を作動させる低分子化合物の探索を行う. 本年度は、糖鎖生合成の破綻を起こした状況を模擬するために、幾つかの硫酸化糖鎖生合成酵素遺伝子のノックアウト細胞をゲノム編集により作出し、その解析を行った。計画していた硫酸化糖鎖生合成酵素遺伝子を欠損させたノックアウト細胞株の作成はほぼ終了した。作成したノックアウト細胞の硫酸化糖鎖生合成酵素遺伝子群の発現レベル、及びこれらが合成する糖鎖を解析した。硫酸化糖鎖の修飾が阻害されている細胞、あるいは特殊な糖鎖構造の発現が変化している細胞を作出できたことが確認された。また、プロテオグリカンの合成が活発に行なわれる時、合成されるコアタンパク質に対してゴルジ体の糖鎖修飾能が不足すると考えられ、このような状況を打破するために糖鎖合成酵素遺伝子の発現を誘導するシステムが備わっているという考えられる。この仮説を証明するために、Tet-on システムによりコアタンパク質の発現を薬物で誘導できる細胞を作出した。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
CRISPR-Cas9 システムを利用したゲノム編集により糖鎖合成酵素遺伝子を改変したノックアウト細胞の作出がほぼ終わった。また、作出した細胞が合成する糖鎖を解析した結果、当初の目的通り、糖鎖合成に異常を起こした細胞の作成がうまくいったことが確認できた。また、コアタンパク質の合成に呼応してゴルジ体の糖鎖合成酵素遺伝子の発現を誘導するシステムの存在を示すために、Tet-on システムによりコアタンパク質の発現を薬物で誘導できる細胞を作出した。これらにより、解析すべき対象細胞の準備が整ったことになるため、本研究課題は概ね順調に進行していると言える。
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| Strategy for Future Research Activity |
糖鎖合成異常がゴルジ体ストレス応答を発動させるかどうかを明らかにするために、平成２９年度に作出した糖鎖合成に異常を起こした細胞や薬物によりコアタンパク質の発現を誘導できる細胞を用いて、ゴルジ体ストレス応答の活性化レベルを調べる。また、ノックアウト細胞の作出に用いた細胞は神経幹細胞株であるので、βIII-チューブリンや MAP2 遺伝子などの神経マーカーの発現を指標に、糖鎖の変化により神経分化のステージが影響を受けているかどうか調べる。さらに、前述の細胞を分化誘導条件で培養した時、神経細胞への分化に影響が生じるかどうか調べる。また、糖鎖合成異常を感知して作動するシステムの標的遺伝子である糖鎖合成遺伝子を探すために、作出した細胞の糖鎖合成酵素遺伝子の発現を調べる。
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| Causes of Carryover |
発注の時期が遅れたため次年度使用額が生じたが、研究は計画通り進んでいる。
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Research Products
(7 results)
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[Journal Article] Synthesis of chondroitin sulfate CC and DD tetrasaccharides and interactions with 2H6 and LY111.2018
Author(s)
Matsushita, K., Nakata, T., Takeda-Okuda, N., Nadanaka, S., Kitagawa, H., and Tamura, J.
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Journal Title
Bioorg. Med. Chem.
Volume: 26
Pages: 1016
DOI
Peer Reviewed / Open Access
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