2017 Fiscal Year Research-status Report
タンパク質構造形成における重要部位探索とその進化における選択要因解明
| Project/Area Number |
17K07368
|
|---|
| Research Institution | Kyoto Prefectural University |
|---|
Principal Investigator |
高野 和文 京都府立大学, 生命環境科学研究科, 教授 (40346185)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | タンパク質 / 立体構造 / アミノ酸変異 / 配列アライメント |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
本年度は、Sulfolobus tokodaii由来エステラーゼ（Sto-Est）に関して、エラープローンPCRによる変異導入と特性評価による選択を繰り返し、多重変異体を作製し、変異体の配列アライメントなどからタンパク質の立体構造形成における重要部位（残基）を同定する実験系の構築と、それらの結果を得ることを行った。
まず、エラープローンPCRにより、エステラーゼ遺伝子にアミノ酸置換を3～5個程度導入し、それらの変異体の活性と安定性評価を、プレートによる新たな手法を導入して、簡便に行う系を立ち上げた。活性や安定性に致命的な変異体は、脱落変異体として、配列を決定し、置換部位を致命的部位の候補とした。活性・安定性を維持した変異体は、さらにエラープローンPCRを繰り返し、変異導入を進めた。
現在までに、脱落変異体から幾つかの致命的部位候補を同定することができた。これらの候補については、別途、部位特異的変異法により、そのブイの特性を実際に評価する予定である。また、変異導入を進めている系では、まだまだ変異が導入可能で、まだ配列アライメントを用いた致命的部位候補の同定には至っていない。今後は、さらなる変異導入を繰り返す予定である。
さらに、当初の予定には入っていなかったが、好熱性のプロテアーゼであるサチライシンにおいても、同様の実験系を立ち上げ、実験を進めている。エステラーゼだけでなく、サチライシンでも実験を行うことで、得られた知見の普遍性を検証できると期待される。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
エステラーゼを用いた変異部位を蓄積させる系では、まだまだ変異が導入可能で、まだ配列アライメントを用いた致命的部位候補の同定には至っていないので、少し遅れているが、サチライシンの系を立ち上げ、普遍性の検証に役立てられるため、総合的には、順調に進展している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
エステラーゼについては、当初の予定通り、Thermococcus kodakarensis由来エステラーゼ（Tk-Est）や、Alicyclobacillus acidocaldarius由来エステラーゼ（Aac-Est）を用いた実験も展開していく。
|
