2019 Fiscal Year Research-status Report
Rab2の細胞内ターゲティング過程の再構成と分子機構解明
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17K07379
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| Research Institution | Tokyo Institute of Technology |
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Principal Investigator |
加納 ふみ 東京工業大学, 科学技術創成研究院, 准教授 (10361594)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 再構成 / Rabタンパク質 / セミインタクト細胞 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
低分子量Gタンパク質Rabファミリーは約60種類のタンパク質から形成され、各タンパク質が特定オルガネラに局在化し小胞輸送における様々な素過程に関与することが知られている。それぞれのRabタンパク質の特定オルガネラへの局在化メカニズムは一次配列によるものではなく、他のタンパク質との相互作用をもとに決定されると考えられる。本研究では、連鎖球菌毒素ストレプトリシンOを用いて細胞膜を透過性にした細胞型試験管セミインタクト細胞を用いて、リコンビナントタンパク質として精製したRab2タンパク質のER-Golg intermediate compartment (ERGIC, 小胞体-ゴルジ体中間区画)ターゲティング過程の再構成系を構築し、Rab2のERGIC局在化制御因子の探索を進めた。Rab2ターゲティングに必要な因子候補として、既存のRab2結合タンパク質に注目した。当該タンパク質に対する抗体を添加しRab2ターゲティングアッセイを行ったところ、抗体濃度依存的なRab2タンパク質のERGICターゲティングの減少が見られた。また、当該タンパク質のRNAiを行ったところ、ゴルジ体の若干の断片化とともにERGICに局在化するRab2量が減少していた。以上の結果から、当該Rab2結合タンパク質がRab2のERGICターゲティングに関与することが示唆された。また、Rab2リコンビナントタンパク質に結合し質量分析によって同定された新規Rab2結合タンパク質に対して弱いRab2への結合が確認されたため、引き続きRab2のERGIC局在への関与を検証することとした。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
構築したRab2タンパク質のERGICターゲティングアッセイを用いて、既存のRab2結合タンパク質の関与を明らかにし、また生細胞でのRNAiの結果からも同様のことが示唆された。さらに質量分析の結果同定した新規Rab2結合タンパク質についてはRab2タンパク質との結合が見られなかったが、条件検討の結果弱いながらも結合が確認できた。
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| Strategy for Future Research Activity |
既存のRab2結合タンパク質についてはERGICターゲティングへの関与を示せたため、今後はRab2の細胞内での機能への関与について検証を進める。また、新規Rab2結合タンパク質についてもRab2のERGIC局在化制御因子である可能性がまだ残っているため、ERGICターゲティングアッセイ、RNAiなどによるRab2局在化への関与を検証する。
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| Causes of Carryover |
研究計画では、Rab2結合タンパク質を質量分析により同定し、Rab2のERGICターゲティング過程再構成系を用いて機能検証を行う予定であった。しかし、質量分析で同定されたタンパク質とRab2との結合確認が思うように進まず、遅れが生じた。次年度はこれまでに同定されたRab2のERGICターゲティング制御候補因子についてその機能を検証するため、当該因子のノックダウンなどの細胞生物学的・生化学的実験を行うための試薬などを購入する。
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