2018 Fiscal Year Research-status Report
ショウジョウバエyki mRNAの細胞内局在、翻訳抑制関連因子の同定と機能解析
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17K07385
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| Research Institution | Kyoto Institute of Technology |
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Principal Investigator |
吉田 英樹 京都工芸繊維大学, 応用生物学系, 准教授 (30570600)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ショウジョウバエ / yki mRNA / 翻訳抑制 / P-body |
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| Outline of Annual Research Achievements |
yki mRNAの3’UTRを用いて生化学的に精製し質量分析機により同定した13種の候補因子に関して、ショウジョウバエの培養細胞を用いて、yki mRNAとの関係性を解析した。候補遺伝子13種のノックダウンによってもyki mRNAの量は変化せず、細胞内局在に影響を与える遺伝子を4種同定した。これらは全て、ノックダウンによりyki mRNAのP-body局在が消失することから、P-bodyにおける翻訳抑制において機能することが予想された。しかし、予想に反し、このうちの2つのノックダウン細胞では、Ykiタンパク質量の有意な増加が検出された。この理由は、現在のところ明らかになっていない。残りの2つの候補遺伝子のノックダウンのyki mRNAの翻訳における役割に関しては、現在解析中である。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
平成30年度に計画していたyki 3’UTR結合候補因子13種の解析を進めた。ショウジョウバエの培養細胞であるS2-DRSC細胞において候補遺伝子をノックダウンし、リアルタイムPCRにより、それぞれの候補遺伝子のmRNAを定量、ノックダウンの効率を調べた。候補因子の残存mRNA量は、内在mRNAと比較し2.3-40%であった。その際のyki mRNAの量、細胞内局在を、それぞれリアルタイムPCR、in situハイブリダイゼーションにより調べた。その結果、yki mRNA量は全てのノックダウン細胞で、コントロールと比較し有意な差が見られなかったが、細胞内局在は、cheerio、Pyruvate carboxylase、Leucyl-tRNA synthetase、Splicing factor 3b subunit 1の4種の候補遺伝子のノックダウンで、P-body局在と思われるドット状のシグナルが有意に減少した。更に、ノックダウン細胞におけるYkiタンパク質の量をウェスタンブロッティング法にて調べた。現在までに、Pyruvate carboxylase、Leucyl-tRNA synthetaseのノックダウンにおいて、Ykiタンパク質量に減少が見られている。これは、Pyruvate carboxylaseやLeucyl-tRNA synthetaseがyki mRNAの翻訳を促進しているとの結果を示唆しており、予想とは異なる結果であった。P-bodyで翻訳抑制されているmRNAは、細胞内の環境により、再び翻訳が再開されることもある。そのため、翻訳を正に制御する因子もP-bodyでmRNAと複合体を形成していることが報告されており、Pyruvate carboxylaseやLeucyl-tRNA synthetaseはそのような翻訳の再開時に必要な因子なのかもしれない。
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| Strategy for Future Research Activity |
平成31年度に予定していた通り、これまでの研究を継続して進めて行く。yki mRNA 3’ UTR結合候補因子をノックダウンし、その細胞におけるYkiタンパク質量をウェスタンブロッティング法により解析する。また、ノックダウンによりyki mRNAの細胞内局在やYkiタンパク質量に影響を与えた候補因子に関しては、RNA免疫沈降法によりyki mRNAへの結合能を調べる。更に、これらの候補因子に関しては、RNAi系統や突然変異系統を用い、それぞれの発現低下や欠損によって、yki mRNAを過剰発現させたショウジョウバエ系統との交配により、遺伝学的相互作用がみられるかを調べる。ここでポジティブな結果が得られた場合、in vivoにおいて候補遺伝子とyki mRNAの翻訳の関係の詳細を調べる。
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Research Products
(20 results)
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[Journal Article] Neuron-specific knockdown of Drosophila HADHB induces a shortened lifespan, deficient locomotive ability, abnormal motor neuron terminal morphology and learning disability.2019
Author(s)
Li J, Suda K, Ueoka I, Tanaka R, Yoshida H, Okada Y, Okamoto Y, Hiramatsu Y, Takashima H, Yamaguchi M.
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Journal Title
Exp. Cell Res.
Volume: 379
Pages: 150-158
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Novel roles of Drosophila FUS and Aub responsible for piRNA biogenesis in neuronal disorders.2018
Author(s)
Wakisaka KT, Tanaka R, Hirashima T, Muraoka Y, Azuma Y, Yoshida H, Tokuda T, Asada S, Suda K, Ichiyanagi K, Ohno S, Itoh M, Yamaguchi M.
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Journal Title
Brain Res.
Volume: 18
Pages: 30646-30652
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Genetic screening of the genes interacting with Drosophila FIG4 identified a novel link between CMT-causing gene and long noncoding RNAs.2018
Author(s)
Muraoka Y, Nakamura A, Tanaka R, Suda K, Azuma Y, Kushimura Y, Lo Piccolo L, Yoshida H, Mizuta I, Tokuda T, Mizuno T, Nakagawa M, Yamaguchi M.
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Journal Title
Exp. Neurol.
Volume: 310
Pages: 1-13
DOI
Peer Reviewed
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[Journal Article] Hippo, Drosophila MST, is a novel modifier of motor neuron degeneration induced by knockdown of Caz, Drosophila FUS.2018
Author(s)
Azuma Y, Tokuda T, Kushimura Y, Yamamoto I, Mizuta I, Mizuno T, Nakagawa M, Ueyama M, Nagai Y, Iwasaki Y, Yoshida M, Pan D, Yoshida H, Yamaguchi M.
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Journal Title
Exp Cell Res.
Volume: 371
Pages: 311-321
DOI
Peer Reviewed
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