2017 Fiscal Year Research-status Report
ヒト多能性幹細胞維持における細胞間コミュニケーションの役割と新規情報伝達機構解析
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17K07395
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
大串 雅俊 京都大学, ウイルス・再生医科学研究所, 准教授 (00462664)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
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| Keywords | ヒト多能性幹細胞 / 細胞間コミュニケーション |
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| Outline of Annual Research Achievements |
研究代表者は、ヒトES細胞のトランスクリプトーム解析を進める中で、神経ガイダンス因子SEMA6AがヒトES細胞で高発現していること、また多能性の喪失に伴い発現がドラスティックに低下することを見いだした。そこで、ヒトES細胞におけるSEMA6Aの機能を明らかとするために、先行研究（Chen Y et al, Cell Stem Cell, 2015）のストラテジーに従いSEMA6Aコンディショナルノックアウト(SEMA6A cKO)ヒトES細胞の樹立を試みた。まず、ヒトSEMA6Aローカス中のエクソン２をflip標的配列で挟んだ相同組換えターゲッティングベクターを作成した。またエクソン2前後のイントロン中に適切なgRNAペアを決定し、それぞれのgRNA発現ベクターを構築した。これらを、Cas9発現ベクターとともにヒトES細胞株KhES-1に導入し、薬剤選択の後、片アレルを欠損、もう片アレルが相同組替え起こした変異株（SEMA6A deltaE2/flip）3ラインをクローニングした。各ラインに対し、薬剤耐性遺伝子カッセットの除去、AAVS1サイトへの人工ホルモン誘導型FLIP（ERT2-FLIP）のノックインを行い、SEMA6A cKO細胞株を得た。それぞれのゲノム改変はPCR及びシークエンスにて確認した。これらを人工ホルモン4-OHTで処理し、エクソン2の欠損が誘導できるかどうかを確認したところ、いずれも先行研究にあるような高効率な遺伝子欠損誘導が認められなかった。現在、その原因を探っているところである。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
3: Progress in research has been slightly delayed.
Reason
先行研究をもとに誘導型ノックアウトの系を構築してみたものの、原因は現在不明だが、論文通りに上手く機能しなかった。
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| Strategy for Future Research Activity |
リコンビナーゼ分子の変更等、先行研究ストラテジーの一部に考えられる改善を加えてつつ、再度細胞調製を試みる。
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| Causes of Carryover |
前年度は研究代表者の異動に伴う研究室引越作業と異動先のセットアップのため、一時期実験ができない期間が生じたため。前年度分の繰り越し分は、前年度の結果から生じた研究方法の改善に向けた実験マテリアルの新規購入などに充てる予定である。
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