2018 Fiscal Year Research-status Report
Attempt to detect and analyze epithelial mesenchymal transition in demosponges
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17K07406
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| Research Institution | Kyoto University |
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Principal Investigator |
船山 典子 京都大学, 理学研究科, 准教授 (30276175)
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| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2021-03-31
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| Keywords | 襟細胞 / 幹細胞化 / 全能性 |
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| Outline of Annual Research Achievements |
昨年度確立した複数の個体当たり１つの芽球を同調的に形成させる芽球形成誘導実験系を用い、誘導0日から8日まで、日ごとの個体からRNAを抽出、RNAseqを共同研究により行った。一部リード数が足りていないが、プレリミナリーな解析として、日ごとに分けず芽球形成誘導の有無でまとめて比較する解析を行った。現在、研究室でこの様なバイオいフォマティクスを行っていず、リファレンス作成などの試行錯誤などに時間がかかったが、発現量に明確な差のある100遺伝子を得た。一連のcollagen遺伝子の発現が上がっていることは、芽球形成過程においてcollagen性の殻が形成される事実と合い、妥当な解析が行えいていると確認出来た。
襟細胞の挙動の解析を目的として、襟細胞を蛍光色素で染色などによる可視化を引き続き試みたが成功に至らず、抗体染色による解析に重点を置くことにした。具体的には、襟細胞の細胞接着構造を検出することを期待し、カワカイメンClassicCadherinに対する抗体を作成、襟細胞のEMTの詳細な解析をめざす。
当研究室の以前のトランスクリプトーム解析から細胞質側にβカテニン結合ドメインを持つEflClassicCadherin１、2の遺伝子配列は得られており、2018年度はそれぞれのC末端側に対応する約2.3 kb, 3 kb部分のクローニングに成功、これを用いてISHによるmRNA発現解析を行った。カワカイメン幼若個体の上皮細胞は非常に扁平でありISHのシグナルは弱いが、EflClassicCadherin2がカイメンの外側上皮細胞に発現していると明らかに出来た。発現量が高くないため襟細胞での発現の有無は明確に出来なかったが、襟細胞も上皮細胞であり強い細胞接着が必要であるはずであるから、ClassicCadherin分子が襟細胞の細胞接着を担っている可能性は高いと考えている。
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| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
芽球形成過程のRNAseqを得、プレリミナリーな解析が行えたことは大きな収穫である。
一方、襟細胞の蛍光色素及び遺伝子導入による蛍光可視化が予想外に困難であり、カワカイメンClassicCadherin１，２のクローニングと抗体作成へ、研究をシフトさせることになったため、この部分は当初の研究計画よりやや遅れている。しかしClassicCadhen全長のクローニングを平行して行っており、カドヘリン遺伝子は８kb余り及び16Kb余りと大きいが、問う研究室のトランスクリプトームデータの配列を用いて、遺伝子の一部はすでに得られており、総合的にはまずまず順調に研究は展開していると考えている。
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| Strategy for Future Research Activity |
襟細胞を含むカイメン上皮細胞の細胞接着部位を検出できる抗カドヘリン抗体を作成する。具体的には、カドヘリンリピート部分を大腸菌で大量発現させHISタグを用いて精製、抗原とする。得られた抗体を用い、当該研究ですでに確立した同調的な芽球形成誘導を用い、襟細胞のEMTを伴う幹細胞化をとらえ、その過程の詳細を細胞形態及びカワカイメン全能性幹細胞特異的遺伝子の発現で解析する。
カワカイメンカドヘリン分子と蛍光タンパク質の融合タンパク質を、当研究室で確立した手法を用いて一過的に発現させ細胞接着部位への局在、細胞接着能の解析も平行して試みる。
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| Causes of Carryover |
当初の研究計画の取り組みが実際には非常に困難だったため研究の進行が遅れたため。2019年度には、大腸菌に抗原タンパク質を大量発現させ精製、抗体作成を外注する。このため主に大腸菌からのタンパク質精製に必要な試薬、及び抗体作成の費用として用いる予定である。
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Research Products
(3 results)
