2017 Fiscal Year Research-status Report

生殖細胞の分化・増殖に必須なmRNA安定性制御機構の解明

Research Project

Project/Area Number	17K07411
Research Institution	Kobe University
Principal Investigator	坂本博神戸大学, 理学研究科, 教授 (00187048)
Project Period (FY)	2017-04-01 – 2020-03-31
Keywords	生殖細胞 / クロモドメイン蛋白質 / 3'非翻訳領域 / mRNA安定性
Outline of Annual Research Achievements	線虫の生殖細胞の分化・増殖に必須なクロモドメインタンパク質MRG-1の始原生殖細胞への限局は、生殖細胞系列と体細胞系列において母性mrg-1 mRNAの安定性が異なることによるものである。このmRNA安定制御は3’非翻訳領域（3’UTR）に依存しているが、詳細な機構は不明である。本研究では、3’UTRに存在するmRNA安定性制御に必要十分なシス配列を明らかにするとともに、シス配列に相互作用する因子を同定し、mrg-1 mRNAを生殖細胞系列で安定化し、体細胞系列で分解する機構の全容を解明することを目的とする。平成29年度はまずmrg-1 mRNAの3’UTR（全長250塩基）によるRNA安定性制御シス配列の解析を進めた。この3’UTR内にステムループ構造をとる部分を中心に欠失変異体を作成し、レポーターmRNA由来のGFP蛍光を観察した結果、このステムループ構造は安定性制御に関与していないことが示唆された。また、mrg-1 3’UTRに相互作用する因子を同定するために、GFP-ヒストンの下流に、MS2結合配列 (MS2コートタンパク質の認識配列)とmrg-1の3’UTRを付加したレポーターmRNAを発現するトランスジェニック系統を作製した。このトランスジェニック系統を大量培養し、その胚から得られた抽出液をMS2コートタンパク質と混合し、レポーターmRNAを免疫沈降することによって、レポーターmRNAと相互作用するタンパク質を回収した。これらのタンパク質を質量分析法によって解析したところ、想定外の細胞骨格系のタンパク質であるミオシン、トロポミオシン、アクチンなどを同定することができた。
Current Status of Research Progress	Current Status of Research Progress 2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned. Reason 平成29年度に予定していた研究計画は概ね順調に進んだが、学内共同利用機器を利用している質量分析の予約状況が混み合っていたため、一部の試料の解析を平成30年度に繰り越すことになった。
Strategy for Future Research Activity	RNA安定性制御とは一見無関係な細胞骨格系のタンパク質がmrg-1 の3’UTRに相互作用することが明らかになったので、この相互作用の妥当性を検証するために、まずはmrg-1の3’UTRをもつレポーター系統において、これらの細胞骨格系タンパク質をRNA干渉法によって阻害し、その効果を評価することを最優先とする。
Causes of Carryover	学内共同利用機器である質量分析装置の利用状況を勘案し、一部の解析を次年度に繰り越すことにしたため。繰越額は平成30年度に質量分析経費として使用する予定である。