2018 Fiscal Year Research-status Report
| Project/Area Number |
17K07415
|
|---|
| Research Institution | Keio University |
|---|
Principal Investigator |
廣田 ゆき 慶應義塾大学, 医学部(信濃町), 講師 (00453548)
|
|---|
| Project Period (FY) |
2017-04-01 – 2020-03-31
|
| Keywords | 大脳皮質 / ニューロン移動 / リーリンシグナル |
|---|
| Outline of Annual Research Achievements |
大脳皮質発生において、脳室帯で誕生したニューロンは多極性細胞として一過性に脳室下帯に留まり移動するが、その分子機構には不明な点が多く残されている。リーリンシグナルはニューロン移動と層形成を制御する重要なシグナル経路であり、移動ニューロンに対して多様な作用を及ぼすことが知られているが、その詳細な分子メカニズムには不明な点が残されている。私達は最近、脳室下帯ニューロン移動においてリーリン受容体ApoER2がネトリン受容体Unc5Dと相互作用すること、分化後の皮質ニューロンから分泌されるFLRT2リガンドとUnc5Dを介した細胞移動制御にApoER2が必要であることを見出した。そこで本研究ではApoER2とUnc5Dとの結合に着目し、これらが共受容体としてニューロン移動を制御する可能性を検討している。
本年度はFLRT2の発現分布に着目した。野生型マウス胎生期の脳では、FLRT2は皮質板のニューロンで発現することが報告されている。私たちはFLRT2の分布を詳細に検討し、脳表層にある辺縁帯においてFLRT2の局在を認めた。このシグナルは大脳皮質においてFLRT2が欠損しているFLRT2コンディショナルノックアウトマウスにおいて消失していた。このことから、FLRT2は皮質板のニューロンにおいて発現し、辺縁帯内へと局在すると考えられる。辺縁帯においてはApoER2に加えてもう一つの主要なリーリン受容体であるVLDLRが発現しており、ApoER2、VLDLRのノックアウトマウスではそれぞれ辺縁帯内部への移動ニューロンの進入が認められる。そこでVLDLRとFLRT2の相互作用を検討した結果、両者の結合が認められた。これらの知見は、辺縁帯直下においてUnc5D/ApoER2/VLDLRがFLRT2に対する受容体として働く可能性を示唆している。
|
| Current Status of Research Progress |
Current Status of Research Progress
2: Research has progressed on the whole more than it was originally planned.
Reason
本年度はFLRT2が辺縁帯に局在することと、VLDLRがFLRT2と結合することを明らかにした。この知見は、ApoER2がFLRT2から受けるニューロンの反発作用に必要であることと合わせて考えると、ニューロンから分泌されたFLRT2が辺縁帯に到達したApoER2/VLDLRを発現する移動ニューロンに結合し、その移動を制御する可能性を示唆しており、重要な知見である。
一方、昨年度から継続して生体内でUnc5Dをノックダウンおよびノックアウトするために、複数種類のベクターを細胞株において検証し、効果のある配列を見出した。これらを子宮内エレクトロポレーションによって移動ニューロンに導入し、その移動に与える影響を検討したが、いずれも移動に変化はみられなかった。そこで現在は辺縁帯内へニューロンの進入がみられるApoER2およびVLDLRノックアウトマウスに着目し、FLRT2への反応性の変化を検討している。
|
| Strategy for Future Research Activity |
1. ApoER2/VLDLR/Unc5D複合体に対するリガンドの作用：ApoER2/VLDLR/Unc5Dの複合体のリガンドとしてリーリン、FLRT2が作用すると想定される。そこでApoER2とUnc5Dがこれらのリガンド刺激が及ぼす影響を検討する。
(1-1) リーリンシグナルの評価：リーリンシグナル下流エフェクターのDab1のリン酸化を、Dab1抗体による免疫沈降と抗リン酸化チロシン抗体によるウエスタンブロットで評価することができる。野生型マウスとUnc5Dノックアウトマウス大脳皮質から初代培養を行い、リーリン刺激時のDab1のリン酸化が変化するかを検討する。
(1-2) FLRT2のニューロン細胞膜への結合に、ApoER2, VLDLRが必要であるかを検証する。FLRT2の細胞外ドメインにアルカリフォスファターゼ（AP）を融合させたタンパク質を発現するベクターを作成し、ApoER2, VLDLRノックアウトマウスからの大脳皮質のプライマリーカルチャーに対して結合を観察する。
２. ApoER2/VLDLR/Unc5D複合体のin vivoにおける機能解析：FLRT2とApoER2/VLDLRの結合部位を絞り込むために、両者の部分欠失変異体を作成する。これを用いて免疫沈降により結合部位を同定する。また、子宮内エレクトロポレーション法により結合部位のみを発現させることにより、ドミナントネガティブ型として機能を阻害するかを検討する。また、結合部位を欠失させたApoER2, VLDLRをそれぞれのノックアウトマウスに発現させ、レスキューさせる効果に影響があるかを検討する。
|
| Causes of Carryover |
当初予定していたより安価な試薬で実験を行ったため、次年度使用額が生じた。次年度の消耗品に使用する予定である。
|
